人巨细胞病毒通过P24蛋白调控DAF表达逃避宿主补体杀伤的机制研究

鉴于人巨细胞病毒（HCMV）对免疫能力低下/缺陷的人群（如胎儿、新生儿和器官移植患者等）以及妇女宫颈感染的严重危害性，人们近年来做了大量研究并发现HCMV能有效躲避宿主补体系统的杀伤是导致病毒在体内长期存活并致病的重要原因。近来的最新研究和我们的前期实验证实，补体负性调控蛋白促衰变因子（DAF）是HCMV实现免疫逃逸的关键因子，HCMV可能通过影响DAF在感染细胞上的表达以及在病毒包膜上结合宿主来源的DAF来抑制补体及整个免疫系统的激活，但具体机制还不清楚。本研究围绕HCMV免疫逃逸这一世界性难题，在前期工作基础上，首次提出"HCMV通过P24蛋白调控DAF的胞内转运、胞膜表达以及与病毒包膜的连接，进而实现对宿主补体系统的逃逸"这一假设，并综合运用多种先进技术和研究手段进行小心求证。本课题还将结构生物学的理论和实验方法引入到病毒免疫逃逸研究领域,为病毒免疫学研究探索一条新的途径。

我们的研究发现并证实，HCMV感染T淋巴细胞和DC细胞后，能明显导致细胞表面的DAF蛋白的表达上调，且这种上调呈时间依赖性。但是细胞中DAF总蛋白（即细胞膜与胞质中的蛋白）的表达水平在感染阴/阳性以及不同时间点之间无明显的改变； 其基因转录水平在各组及各时间点之间亦无统计学差异。这一结果表明：HCMV对T淋巴细胞和DC细胞中的DAF具有调控能力， 且这种调节方式是在转录后的蛋白水平调控。其次，HCMV感染阳性的T细胞和DC细胞P24蛋白复合体表达明显上调，进一步检测则发现是P24蛋白复合体中的δ亚基表达水平明显上调，而其他三个亚基则无统计学改变。通过RNA干扰以及基因过表达实验，我们进一步证实P24蛋白基因被沉默后（无论是否被感染）DAF蛋白在胞内的转运能力以及在包膜上的表达水平都会显著降低；而P24基因重新恢复表达后上述改变则会消失；且在HCMV感染阴性的细胞中，P24蛋白δ亚基的基因过表达会导致DAF蛋白的表达上调。上述实验结果暗示，P24蛋白在DAF的胞内运输过程中具有十分重要的作用，且HCMV可能是通过对P24蛋白δ亚基的干预来调控DAF蛋白的表达的。为了进一步了解P24蛋白对DAF蛋白胞内转运的具体途径，我们通过激光共聚焦、酶免疫电镜、病毒纯化、质粒转染等技术发现：HCMV感染阳性细胞中DAF蛋白在内质网和高尔基体中的聚集量明显多于HCMV感染阴性的细胞，而且在高尔基体中的富集量要多于在内质网中的富集量；此外我们还发现，病毒颗粒在高尔基体中及周围的富集量也远多于其它细胞器。如将P24蛋白基因沉默后，DAF蛋白在上述细胞器以及病毒颗粒中的富集量明显减少。综合上述研究结果，我们基本证实了我们的猜想，即HCMV能通过P24蛋白的δ亚基调控DAF蛋白在胞内的转运，并最终决定其在细胞表面以及病毒中的表达水平。此外我们还发现DAF可能参与了宫颈癌的侵袭与转移，并初步证实DAF及其配体在宫颈癌组织的表达水平明显高于正常组织及癌前病变组织；DAF及其配体的上调表达与宫颈鳞状细胞癌的FIGO分期及淋巴结转移具明显相关性，并可作为独立的预后不良指标。