肿瘤相关中性粒细胞和中性粒细胞弹性蛋白酶在肿瘤生长、转移中的作用及ZX-1201和西维来司钠的比较研究

Tumor associated neutrophils (TANs) and their produced neutrophil elastase (NE) play an important role in tumor development. NE is one of the main components of neutrophil extracellular traps (NETs) , NETs can be formed in cases of infection, cancer etc., and to promote the development of these diseases, but the key role of NE in NETs needs to be confirmed. In recent years, TGF-β1 has been found to facilitate the polarization of TANs from type N1 (anti-tumor) to N2 (tumor-promoting, NE can be secreted by N2), but the mechanism is unknown. We previously found that several natural products including ZX-1201 (a single compound of triterpenes) like sivelestat (NE inhibitor) could significantly inhibit NE activities. Moreover, ZX-1201 could significantly reverse the TGF-β1 induced cancer cell growth, migration and cancer metastasis. Molecular docking showed that it could directly bind with TβRI and NE respectively. Based on our previous works, in this proposed study, we will compare the effects of ZX1201 and sivelestat on cancer growth and metastasis, including their role in regulating phenotypic polarization of TANs and their possible mechanisms; their inhibitory effect on NE, and the contribution of NE on the formation of NETs; the regulatory effect of both compounds on NE and on the upstream or downstream molecules of NE and potential signaling network. We hope our results can provide clues and experimental evidences for the development of new anti-cancer drugs.

肿瘤相关中性粒细胞（TANs）及其所产生的中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）在肿瘤发生发展中起重要作用，NE是中性粒细胞胞外陷阱（NETs）的主要成分之一，NETs可在感染、癌症等情况下形成，并促进这些疾病的发展，但NE在NETs中的关键作用尚需证实。近年来发现TGF-β1可以促使TANs的N1型（抗肿瘤）向促肿瘤的N2极化（NE由N2型分泌），机制不明。我们前期发现几种天然产物，包括ZX-1201（三萜类）与西维来司钠（NE抑制剂）均能抑制NE的活性；ZX-1201并能逆转TGF-β1诱导肿瘤细胞的生长和迁移，分子对接显示其可直接与TβRI受体以及NE结合。本研究将比较ZX-1201与西维来司钠抑制肿瘤生长、转移作用的差异，包括它们调节TANs表型极化的作用及可能的机制；它们对NE的抑制作用；NE在NETs中的贡献；以及它们对NE上下游分子的调节及信号网络，为发展新的抗肿瘤药物提供线索和思路。

肿瘤相关中性粒细胞（TAN）在肿瘤发生发展中起重要作用。中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）， 是由N2亚型（促肿瘤）分泌的，也是NETs的主要成分之一。TGF-1不仅可以促进肿瘤细胞迁移及EMT，而且可以促进TANs从N1型（抗肿瘤）向N2型（促肿瘤）极化。ZX-1201 是源自于天然产物的单体化合物，我们前期发现它能逆转TGF-1诱导的肺癌及胰腺癌的生长、转移和EMT。本研究中我们首先证实ZX-1201可以抑制肺癌细胞存活和迁移，而NE抑制剂西维来司钠则无此作用，表明单一抑制NE对肿瘤细胞生长并无影响。我们还发现ZX-1201可诱导肺癌细胞IRS-1（NE底物）及α1-AT（NE内源性抑制剂）。并通过抑制SMAD通路及非经典通路抑制A549细胞由TGFβ1诱导的EMT。采用分子对接、SPR及香豆素荧光探针标记，我们发现ZX-1201可与TBRI和TBRII结合，抑制受体复合物的形成。由于TGFβ1也参与TANs的极化，我们采用DMSO或ATRA +TGFβ1诱导HL-60白血病细胞极化，发现ZX-1201可以增加N1表型，减少N2表型，降低HL-60细胞TBRI受体表达。整体动物研究也产生了相似的结果。进一步我们制备了TAN的条件培养基（ATRA+TGFβ1诱导HL-60细胞极化），给予ZX-1201后发现该条件性培养基对A549的迁移有明显的抑制作用。最后我们采用生物信息以及网络药理学，根据患者的基因表达矩阵给515 名肺腺癌患者进行了中性粒细胞浸润程度的评分等，获得了BTK、CD33、HPGDS、LY86、MNDA 和 P2RY12 六个关键基因，并利用 ZX-1201 反向找靶方法发现 P2RY12 可能是 ZX-1201 的唯一靶点。并进而在肺腺癌患者的临床样本中验证了 P2RY12 的表达差异。利用裸鼠肿瘤异体移植模型通过小动物活体成像系统等发现 ZX-1201 和 P2RY12 抑制剂替格瑞洛可能显著抑制肺癌细胞的生长。而且ZX-1201和替格瑞洛均可能通过抑制P2Y12，抑制血小板聚集。ZX-1201对血小板聚集的抑制作用可能是其通过抑制中性粒细胞、NETs，进而抑制肿瘤转移的主要作用机制之一。对P2Y12与免疫细胞相互作用调节肿瘤生长转移的关系值得进一步研究，我们的研究为发展新的肿瘤抑制药物提供了新的思路和实验依据。