AQP1参与TGF-β诱导肿瘤上皮间质转化及调控网络研究和化合物ZX-1201的作用及机制

Through epithelial-mesenchymal transformation (EMT), the tumor cells enhance their capacity of migration and invasion, TGF-β play an important role on EMT process. In a variety of malignancies, the AQPs are biomarkers on certain kinds of tumors and have been recognized as one of the targets on anticancer drugs discovery. Our recent study revealed a compound ZX-1201 from Alisma could significantly reverse TGF-β1 and EGF-induced tumor cell EMT and their migration by inhibition of AQP1 and TGF-β1 expression. This proposed study intend to explore the role of AQP1 on TGF-β1 induced EMT and tumor growth and metastasis. And observe the effects of ZX-1201 and its derivatives. We will focuses on the possible mechanisms of TGF-β1 on its self activation and its downstream events, to clarify the possible relationship with AQP1. We will study TGF-β1 / Smad / AP1, Notch / Gata3, Six1 / miR106b-25/TGF-β1 pathways on AQP1 regulation and EMT and tumor metastasis. To examine ZX-1201 compounds on regulating these networks and validate the possible targets, provide clues for the development of new drugs on anti-tumor and anti-tumor metastasis.

肿瘤细胞通过上皮间质转化（EMT）而增强自身的迁移和浸润能力，TGF-β是EMT的主要诱导者。AQPs是多种肿瘤生长的生物标志物，并影响肿瘤的转移和肿瘤细胞的迁移，AQP1是否参与肿瘤的EMT过程及其调节机制尚未见报道。我们的前期研究发现来自于泽泻的单体化合物ZX1201能明显逆转TGF-β1诱导的肿瘤EMT过程，并通过抑制AQP1和TGF-β1的表达和功能而抑制肿瘤细胞的迁移。本课题拟探讨AQP1在TGF-β1诱导的肿瘤EMT以及肿瘤生长和转移中的角色；研究TGF-β1自我激活的机制及其下游事件与AQP1的关系，包括TGF-β1/Smad/ AP1、Notch/ Gata3、Six1/ miR106b-25/TGF-β1对AQP1的调节；构建扩展的网络，确定调节该网络的关键节点；研究ZX1201对上述途径和网络的作用，优化ZX1201的结构，为发展抗肿瘤及肿瘤转移的新药提供线索和思路。

各类癌症中，胰腺癌具有非常高的致死率，吉西他滨可改善临床症状并延长生存期，但仅能延长三个月左右。天然产物的特点是低毒、多靶点，ZX-1201是泽泻的三萜类活性成分之一。本课题首先通过离体、整体研究以及高内涵技术等研究发现ZX-1201对TGF-β1诱导PANC-1细胞迁移有明显的抑制作用，使实时运动位移、实时运动速度、平均运动位移和平均运动速度均明显降低；该药拮抗TGF-β1，并上调上皮表型标志蛋白，下调间质表型标志性蛋白的表达。活体成像研究证实ZX-1201在30 mg/kg/d，共21d即可明显抑制胰腺癌细胞生长和转移，并降低CA19-9浓度，而腹腔注射吉西他滨25mg/kg/2d或者50mg/kg/4d则明显降低小鼠体重，一周左右便出现死亡。因此，相对于吉西他滨，ZX-1201的有效剂量较低，毒性很小，是胰腺癌治疗潜在的先导化合物和辅助治疗药物。进一步我们发现ZX-1201对PANC-1细胞Six1/ miR106b-25 通路无明显影响，但可降低Smad2/3的磷酸化水平，下调Snail的表达。Stopped-flow技术证实ZX-1201 可抑制AQP1的水转运功能，计算机分子对接发现ZX-1201能够直接与AQP1结合，其最优结合能为-26.8247 kcal/mol，其中ASP210和TRP212在氢键的形成中起决定性作用。蛋白质组学和SAM、Cytoscape及其BisoGenet和BinGo分析得到变化最明显的细胞迁移相关基因CTGF，生物学验证发现ZX-1201可剂量依赖性地降低TGF-β1诱导的AQP1和CTGF的表达；敲降AQP1和CTGF后，PANC-1细胞迁移能力下降，并显著抑制PANC-1细胞的平均运动速度和运动位移；ZX-1201也可以抑制GSK-3β的磷酸化。结论ZX-1201可通过抑制AQP1/GSK-3β/β-catenin/CTGF以及抑制TGF-β1/Snail/Smad2/3/β-catenin/CTGF通路来逆转EMT过程和抑制胰腺癌的转移。此外我们也研究了咖啡酸苯乙酯（CAPE）对中性粒细胞弹性蛋白酶诱导的胰腺癌PANC-1细胞活力及细胞迁移的影响，并研究了双甲氧基姜黄素协同吉西他滨对胰腺癌细胞产生抑制的作用及其机制。总之该项目的实施，不仅使我们对胰腺癌的分子机制和遗传基础有了更深入的认识，并为新药的研究奠定了基础。