内切木聚糖酶定向导入拟水相载体及其自萃取生物转化

内切木聚糖酶（XYN II）是一种重要的糖苷水解酶，广泛应用于食品、医药、纺织、制浆造纸等领域。近年来，木聚糖酶固定化技术存在不溶性大分子底物扩散困难、缺乏基于酶分子结构的合理固定化技术以及固定化酶较难回收等问题，限制了固定化木聚糖酶在实际中应用。本项目以源于里氏木霉的XYN II为研究对象，通过对酶分子的空间结构、催化活性和底物结合等特征的分析，在酶分子末端选择合理的改造位点进行分子改造，再选择恰当的拟水相载体，使酶分子与拟水相载体定向对接，构建拟水相载体固定化XYN II。在此基础上，探索性研究拟水相载体固定化XYN II自萃取生物转化不溶性大分子木聚糖，实现固定化XYN II的原位分离，为拟水相载体固定化酶研究提供可借鉴的应用基础研究。

木聚糖酶是一种重要的糖苷水解酶，主要用于水解不溶性底物-木聚糖制备低聚木糖。低聚木糖又是一种性能优异的益生元，具有无龋齿性、低热量、不消化和增殖肠道有益菌群。木聚糖酶固定化研究中存在固定化酶与底物的可及性降低、合理固定化技术、固定化酶较难回收、反应速率下降、传质受限制等问题。因此，本课题采用定点突变技术改造木聚糖酶XYNII，提高其稳定性；再利用拟水相载体固定化木聚糖酶，提高固定化酶与底物可及性、提高反应速率、克服固定化酶难回收。研究成果如下：.1）基于木聚糖酶XYNII的分子结构分析，定点突变改造XYNII，在木聚糖酶XYNII分子内构建二硫键，突变效率为92.5%，转化效率为100%。测序与序列比对证明，SS突变XYNII分子内的N-末端成功构建一个二硫键，并电转化毕赤酵母GS115。.2）表达的突变木聚糖酶酶学性质表明，SS突变XYNII的最适反应温度为60℃，70℃的半衰期为14min。通过加入二硫键，使木聚糖酶的耐热性和热稳性均增强。SS突变XYNII的最适反应pH值为5.0；在50℃、60min条件下，SS突变XYNII的pH稳定范围为pH3.0~10.0。.3）发酵罐高细胞密度表达SS突变XYNII，研究表明甘油溶氧反馈至OD600=200-甲醇脉冲式诱导表达，获得的木聚糖酶表达量最高，最终细胞密度OD600为602，木聚糖酶活力可达1353 IU/mL，蛋白浓度为2.98g/L。.4）源于里氏木霉的SS突变XYNII固定于拟水相载体（mPEG5000），酶活回收率为72%，氨基修饰率为83%。固定化SS突变XYNII在pH4.0-6.0，温度50-65℃范围内较稳定。固定化SS突变XYNII的最适pH值和最适温度分别为6.0和60℃。采用质量分数为18%的mPEG5000和质量分数为14%的柠檬酸三钠构成自萃取体系，可实现60%以上的酶活回收率。在酶用量50IU/g木聚糖、50℃、280rpm的条件下，拟水相载体固定化酶水解制备低聚木糖，游离酶的酶解得率为68.92%，低聚木糖产率为66.81%；固定化酶的酶解得率为69.27%，低聚木糖产率为67.51%。自萃取生物转化体系对游离酶和固定化酶的酶活回收率分别为64.15%和61.78%。.5）申请发明专利5项，其中授权专利4项。发表学术论文6篇，其中SCI论文3篇，EI论文2篇。培养硕士研究生5名。