生殖域特异表达新基因Rcet1两个剪切本参与精子发生的分子机制研究

Rcet1及人类同源基因Rcet11是我们克隆的在生殖域中特异表达的新基因。Rcet1包括Rcet1_v1和Rcet1_v2两个剪切本，在小鼠大脑、脑垂体、睾丸和附睾等生殖域中特异表达，蛋白产物定位于细胞核中。Rcet1属于Cres亚家族的一个新成员，可能在精子发生中具有重要的组织特异性功能。本研究拟通过点突变内含子与外显子交界的剪切位点，使内含子无法剪切而得不到成熟的mRNA，从而达到基因敲除的目的；拟分别和同时敲除两个剪切本，建立基因敲除小鼠模型，研究它们在大脑、脑垂体、睾丸及附睾发育，雄性激素分泌和精子发生中的作用。同时，通过pull down、质谱分析，免疫共沉淀鉴定与两个不同剪切本相互作用的蛋白；稳定过表达和RNA干扰两个不同剪切本后，利用二维电泳、microRNA芯片分析差异表达分子，研究它们在精子发生中可能的信号途径及分子机制，为男性不育患者的诊断和治疗提供新的思路和靶点。

Rcet1及人类同源基因Rcet11是我们克隆的在生殖域中特异表达的新基因。Rcet1包括Rcet1_v1和Rcet1_v2两个剪切本，在小鼠大脑、脑垂体、睾丸、附睾和卵巢等生殖域中特异表达。本研究完成了Rcet1（Rcet1_v1 和Rcet1_v2）基因敲除、RNA干扰等载体的构建。并将引入突变和neo的靶载体质粒线性化后用电穿孔法将他们导入小鼠ES细胞，经G418筛选获得阳性ES细胞。经传代扩增后将环状pMC-Cre质粒（含Cre重组酶）用电穿孔法导入其内，培养ES细胞。经PCR和Southern blot筛选得到得到敲除Rcet1（Rcet1_v1 和Rcet1_v2）基因的阳性ES细胞。将阳性ES细胞分别注射到小鼠囊胚腔内，经繁育及杂交得到敲除Rcet1（Rcet1_v1 和Rcet1_v2）的杂合子雌雄小鼠。自2012年10月至今，已繁育多代小鼠，但出生后大多死亡。到目前为止，只得到3只纯合体成年小鼠，其中一只雌性小鼠6周后死亡，经解剖发现该雌性小鼠无卵巢，并有一巨大的子宫癌（？）；另两只正在合笼杂交，期望能得到纯合体后代小鼠供后续研究。缺少Rcet1（Rcet1_v1 和Rcet1_v2）基因是否致死？Rcet1（Rcet1_v1 和Rcet1_v2）基因是否为雌性小鼠卵巢发育所必需？缺少Rcet1（Rcet1_v1 和Rcet1_v2）基因卵巢是否无法发育？并发生子宫癌？ Rcet1（Rcet1_v1 和Rcet1_v2）基因对雄性小鼠睾丸发育又有何影响？等等，都值得进一步研究。我们对本课题研究内容有浓厚的兴趣，我们会继续研究下去，直到得到满意的结果为止。目前已发表文章6篇，待发表文章3篇。