睾丸特异表达新基因MSRG-11参与细胞凋亡的分子机制研究

正常精子的发生和极度少精、无精和隐睾症的机制研究一直是生殖健康研究的热点。MSRG-11基因及人类同源基因SPATA17是我们克隆的在睾丸中特异表达的新基因。MSRG-11基因转染实验结果表明该基因能促进细胞凋亡。MSRG-11蛋白属于钙不依赖性钙调素结合蛋白的一个新成员，也是目前在睾丸中首次发现的同时具有促凋亡且含有IQ 基序的蛋白，该基因可能在人类精子的发生以及生殖细胞凋亡中具有重要作用。我们拟建立转基因小鼠模型，研究其在睾丸发育、精子生成和生精细胞凋亡中的可能作用；同时拟通过突变分析等技术确定MSRG-11蛋白促凋亡的关键结构域；并通过pull down、免疫共沉淀、RNAi、二维电泳等技术进一步确定与之相互作用的蛋白及该蛋白促进睾丸生精细胞凋亡的可能信号通路，期望为严重少弱精症、无精症、隐睾患者的诊断和治疗提供新的思路和可能的新靶点。

承担该项目以来，严格按照项目计划书进行，现已完成计划书中的各项指标，3年来共发表研究论文9篇，其中SCI收录7篇，累计SCI影响因子达13.8。培养研究生5人。.　　MSRG-11基因及人类同源基因SPATA17是在睾丸组织中特异表达的新基因。通过生物信息学方法，从模式生物斑马鱼中克隆了MSRG-11基因的同源基因SPATA17，结果显示MSRG-11基因主要在斑马鱼睾丸中表达，卵巢中有微量表达，并通过凋亡检测发现斑马鱼MSRG-11基因能够促进细胞的凋亡。.　　分析了MSRG-11蛋白结构与功能关系，构建了MSRG-11基因的多个突变体的真核表达载体，通过激光共聚焦显微镜观察MSRG-11蛋白的亚细胞定位，结果表明：MSRG-11蛋白及各种突变体主要定位于细胞质中，各突变体蛋白的亚细胞定位无明显差异；同时通过流式细胞仪、TUNEL法等方法检测细胞凋亡情况。确定了IQ motif是促进细胞凋亡的关键结构域。.　　运用CaM Pull-Down技术， 将MSRG-11缺失体蛋白与细胞裂解液和小鼠睾丸组织蛋白提取液进行CaM-Sepharose Pull-down，确定了MSRG-11蛋白与CaM的相互作用, 通过缺失体的构建，确定了MSRG-11蛋白与钙调蛋白（CaM）互作结合区域为IQ motif。进一步通过pull down实验鉴定了MSRG-11与Fas/FasL的相互作用，确定了MSRG-11蛋白促凋亡机制不是通过p53凋亡通路，而是通过与CaM的相互作用，启动Fas/FasL细胞凋亡通路促进生精细胞凋亡。.　　成功构建了MSRG-11转基因小鼠，研究结果表明：MSRG-11转基因小鼠睾丸比正常发育小鼠睾丸曲细精管官腔变窄，体积略小，凋亡细胞数增加到56.4%，表明MSRG-11的过表达导致了生精细胞凋亡加速，但对小鼠正常生育无明显影响。.　　综上所述，我们认为MSRG-11参与了精子形成过程中正常精子的成熟过程，该基因通过与CaM蛋白的相互作用，然后再通过与Fas的作用，形成MARG-11-CaM-Fas三元复合体，从而启动Fas/FasL细胞凋亡通路促进生精细胞凋亡，维持生精细胞正常的凋亡。