非晶状体晶状体蛋白与三叶因子复合物在大蹼铃蟾抗感染免疫中的作用研究

The amphibian skin is a multi-function organ, and the secreted proteins and peptides of the skin are pivotal for deserting its physiological function. A novel protein complex was characterized from the skin of Bombian maxima, which is an Anura amphibian with ecological significance in southwest China. The protein complex consists of one betagamma-crystallin subunit and two trefoil factor subunits. The protein complex was named as betagamma-crystallin and trefoil factor complex, and abbreviated as betagamma-CAT. Based on the murine macrophages, we found that betagamma-CAT was able to activate the inflammasome, which is a multiprotein oligomer consisting of caspase 1, PYCARD, and NALP. Inflammasome is present in many types of cells and is a component of the innate immune system. betagamma-CAT was able to activate inflammasome in Murine macrphages at low concentration. By activating inflammasome, betagamma-CAT induced the secretion of interleukin 1beta by murine macrophages. Further research revealed that betagamma-CAT could also activate the inflammatory caspase-1 in Bombina maxima dermal fibroblast cells. Due to these findings, the following work is decided to be done in this project: (1) the type and the mechanism of inflammasome activation by betagamma-CAT, including the involvement of betagamma-CAT endocytosis in inflammasome activation; (2) the physiological role of inflammasome activation by betagamma-CAT in skin immunity, mainly defensing against microbial infection. The research in this project will not only facilitate the understanding of amphibian skin immunity, but also provide the new methods and clues to elucidate the function of the betagamma-crystallin family.

对两栖动物皮肤分泌物的研究不仅可以增加我们对两栖动物生理的理解，也可以为解释分泌蛋白哺乳动物同源物的生理功能提供帮助。我们从我国西南特有的两栖动物大蹼铃蟾皮肤分泌物中分离纯化得到一种全新的非晶状体betagamma-晶状体蛋白与三叶因子复合物，即betagamma-CAT。以小鼠巨噬细胞为研究对象发现betagamma-CAT可以激活一类全新的天然免疫启动复合物即炎症小体（Inflammasome）。本项目拟在前期工作基础上，以大蹼铃蟾自身为研究对象：1）探讨betagamma-CAT激活自身免疫细胞以及成纤维细胞炎症小体类型与机制；2）在整体动物水平探讨betagamma-CAT激活炎症小体在抵御微生物感染中的作用。研究结果有助于加深对两栖动物免疫的认识，同时为非晶状体betagamma-晶状体蛋白这类功能几乎完全未知蛋白的功能研究提供新的思路与线索。

本项目经过2014年-2016年三年的执行期，基本上按照计划进行并开展了计划书中所列出的主要内容。在项目申请时打算：1）探讨βγ-CAT激活自身免疫细胞以及成纤维细胞炎症小体类型与机制；2）在整体动物水平探讨βγ-CAT激活炎症小体在抵御微生物感染中的作用，拟通过这些研究为晶状体类似蛋白和孔道形成类似蛋白的功能提供新的线索。在以大蹼铃蟾自身为研究模型时发现βγ-CAT在受到细菌感染后表达上调。注射βγ-CAT可以促进大蹼铃蟾的抗感染免疫。βγ-CAT在接触到大蹼铃蟾的腹腔免疫细胞后，会迅速被细胞内吞并运输到溶酶体，其在膜上形成的孔道会引起溶酶体的不稳定性增加，并由此促进溶酶体内的Cathepsin B释放到胞浆中，胞浆中的Cathepsin B则可以诱导NLRP3炎性小体的激活以及下游的Caspase-1活化和促炎性细胞因子IL-1β的分泌。促炎性细胞因子的快速分泌以及中性粒细胞的招募则可以加速感染微生物的清除。我们的研究结果认为βγ-CAT在抗感染免疫中的作用可能代表了一种全新的作用方式。研究结果于2014年发表于PNAS，并被选为当期的封面故事文章。在近年来，越来越多的研究发现孔道形成毒素类似蛋白/孔道形成蛋白参与了众多重要的生理病理过程，如细胞焦亡（pyroptosis），坏死性凋亡（necroptosis）等。说明对包括βγ-CAT在内的可以形成孔道的毒素类似蛋白深入研究非常有必要。然而，在研究过程中发现了很多问题，包括：（1）两栖动物细胞传代次数受限，实验规模难以扩大；（2）两栖动物的冬眠期实验结果不稳定。因此在进一步的研究中，我们将会进一步完善大蹼铃蟾作为实验动物的各项基础性研究，另外，鉴于βγ-CAT类似的蛋白存在于众多模式生物如秀丽隐杆线虫和斑马鱼中，也考虑同时在模式生物开展这类蛋白的功能研究。