缺刻缘绿藻中ArA合成相关酶基因对氮饥饿响应的分子机理

缺刻缘绿藻（Myrmecia incisa）系单细胞绿藻，能够大量合成花生四烯酸（ArA），尤其在氮饥饿条件下，因脂肪酸去饱和酶及延长酶基因转录量的变化，使ArA的含量达到藻体干重的7%以上。那么该藻细胞是否存在类似PII这种信号转导非酶蛋白将氮饥饿信号与这些目标基因的转录联系起来，以合成ArA来度过氮饥饿等不良环境？为此，本申请项目计划在转录组高通量测序的基础上，重点捕获脂肪酸代谢有关的信号通路等信息；克隆PII蛋白、NtcA等基因，测定ATP、a-酮戊二酸、Gln等含量并分析它们与PII蛋白等基因转录量之间的关系；重点地利用基因组步移技术克隆D6和D5去饱和酶及延长酶等基因的启动子；尝试性地利用酵母双杂交或亲和层析等技术筛选与PII相互作用的蛋白或转录因子等。该研究有助于在ArA合成代谢途经基础上，通过信号通路及相关元件的分析更深入地探讨氮饥饿引起缺刻缘绿藻合成并积累ArA的分子机理。

缺刻缘绿藻（Myrmecia incisa）系单细胞绿藻，能够大量合成花生四烯酸（ArA），尤其在氮饥饿条件下，因脂肪酸去饱和酶及延长酶基因转录量的变化，使ArA的含量达到藻体干重的7%以上。那么该藻细胞是否存在类似PII这种信号转导非酶蛋白将氮饥饿信号与这些目标基因的转录联系起来，以合成ArA来度过氮饥饿等不良环境？为此，本申请项目通过转录组高通量测序、基因注释、脂类及类胡萝卜素代谢通路解析等，了解该藻具有C4样的光合固碳途径，预示这它可以生活在低碳环境下；在此基础上，捕获到与脂肪酸代谢有关的信号通路等信息；同时还克隆了编码该藻PII蛋白、N-乙酰-L-谷氨酸激酶（NAGK）、生物素羧基载体蛋白（BCCP）等基因，利用酵母双杂交技术证明PII与BCCP之间没有相互作用，而与NAGK之间存在相互作用，该作用被体外的免疫共沉淀实验证实，且它与PII蛋白基因的转录量之间也存在正相关，从而表明PII可能通过调控NAGK来合成精氨酸以达到重新分配细胞中氨基目的来适应氮饥饿环境；在D6去饱和酶基因的功能鉴定基础上，利用基因组步移技术克隆了它的启动子序列，发现存在感受氮信号等调控元件。同时，该研究还克隆了该藻的D9酰基-CoA去饱和酶、二酰甘油酰基转移酶、油体钙蛋白等基因并通过异源表达鉴定了它们的功能，探讨了它们在氮饥饿过程中对ArA及油脂合成的作用。该研究有助于在ArA合成代谢途经基础上，通过信号通路及相关元件的分析更深入地探讨氮饥饿引起缺刻缘绿藻合成并积累ArA的分子机理。