DNA 损伤应答对FBXO31稳定性调控及其在食管鳞癌耐药性中的作用研究

Studying key DNA-damage-responsive molecules that regulate cell apoptosis upon genotoxic stress is crucial for better understanding underlying mechanisms of chemoresistanc in cancer cells and for discovering rational therapeutic targets. FBXO31, a newly revealed adaptor of SCFFBXO31 E3 ligase, was found accumulated upon genotoxic stimuli to protect cell from stress-induced apoptosis via ubiquitylating substrates including MKK6 (Liu et al., JBC). Yet the underlying mechanism of how DNA damage responses trigger FBXO31 accumulation and the effect of up-regulation of FBXO31 in modulating chemosensitivity of esophageal squamous cell carcinoma (ESCC) remains unknown. The preliminary results from this project suggested that FBXO31-constituted-SCFFBXO31 E3 ligase could auto-ubiquitylate FBXO31 to keep a basal level expression of FBXO31. Based on this finding, this project will apply in vitro and in vivo ubiqutination assay and CHX chase assay to test the hypothesis that DNA-damage-induced accumulation of FBXO31 is due to suppression of auto-ubiqutination and degradation of FBXO31 mediated by SCFFBXO31. Furthermore, in order to examine the role of up-regulation of FBXO31in modulating ESCC chemosensitivity, ESCC specimen based histoculture drug response assay (HDRA) and survival rate in relation to FBXO31 expression in ESCC patients will also be studied. Through this project, a new mechanism of how post-translational modifications regulate FBXO31 expression upon DNA damage may be unraveled, and evidences of up-regulation of FBXO31 conferring cancer cells resistance to chemotherapy may provide a potential therapeutic target for ESCC treatment.

研究DNA 损伤应答中抑制细胞凋亡的重要蛋白对于深入了解肿瘤耐药性机制和构建潜在的靶向药物有重要意义。FBXO31 是近年来发现的SCF E3酶的组成蛋白，在DNA 损伤后该蛋白表达上调，通过介导下游底物（包括MKK6 Liu et al., JBC）的降解而抑制细胞凋亡，对细胞起保护作用。但DNA损伤如何引起细胞内FBXO31表达上调以及FBXO31表达上调对食管鳞癌耐药性的影响尚不明确。本项目前期工作提示无刺激条件下FBXO31稳定性受到SCFFBXO31自泛素化调控，在此基础上本项目拟通过体内外泛素化实验以及CHX追踪等方法来研究DNA损伤应答通过抑制FBXO31自泛素化和蛋白降解而使蛋白表达上调的假说，并通过对临床标本体外药物敏感性检测以及FBXO31表达情况与预后相关性的研究，来明确FBXO31蛋白表达异常对于食管鳞癌耐药性的影响。本项目的实施为克服食管癌耐药性提供新的治疗思路。

本项目以DNA 损伤应答中抑制细胞凋亡的重要蛋白FBXO31为研究对象，重点研究DNA损伤对FBXO31的调控，以及FBXO31上调对食管鳞癌细胞耐药性及预后的影响。旨在为干预 FBOX31增加肿瘤细胞对化疗药物的敏感性, 从而为食管鳞癌的临床治疗提供新的思路。.根据以上研究目标我们展开了一些列的实验，获得了以下的结果：1) 明确了DNA损伤应答在蛋白转录后水平上通过调控FBXO31自泛素化来调控FBXO31蛋白稳定性；2) DNA损伤ATM蛋白激酶可以通过Ser287位点磷酸化部分调控FBXO31的泛素化，S287A 突变并不能完全抑制FBXO31的自泛素化，然而可以部分逆转FBXO31由于DNA损伤而引起的泛素化降低，说明该位点在DNA损伤中有一定作用。同时我们发现FBXO31 351-539aa区域也存在调控蛋白稳定性调控元件，支持其他未知激酶及磷酸化位点在DNA损伤应答中对FBXO31存在调控作用；3) FBXO31可以特异性的调控应激性MAPK（p38 and JNK），从而对细胞凋亡进行调控。FBXO31对于JNK通路的调控是该项目的新发现，在此基础上我们利用质谱技术对FBXO31的结合蛋白进行了鉴定以了解FBXO31如何通过潜在底物调控JNK，该部分内容或许为FBXO31的上游及下游调控，以及进一步揭示FBXO31在DNA损伤应答中的作用机制提供有力线索。5) 发现FBXO31在食管癌临床标本中表达升高（P < 0.001 n = 76），且高表达组中患者的总体生存时间显著低于低表达组（P=0.010)。6）体外Annexin V 流式检测细胞凋亡、WB检测凋亡指标以及体内成瘤实验结果均显示沉默FBXO31增加了食管鳞癌对化疗药物的敏感性。.本项目通过研究FBXO31蛋白转录后调控，通过解析FBXO31在DNA损伤应答中如何受到调控而使其蛋白水平升高，加深了对FBXO31 调控机制认识，扩展了对DNA损伤应答网络的了解；同时本项目发现FBXO31的异常表达对于预后及耐药性的影响，为食管鳞癌的预后判断及治疗提供了新的思路。