基于纯化ZFN、TALEN及Cas9核酸酶蛋白质的“绿色”基因编辑技术

The recent advances in ZFN, TALEN and CRISPR/Cas9-baesd gene editing technologies shed the light on the use of nucleases to treat genetic diseases. Traditionally, nuclease-encoding genes are delivered into cells by lipofection, nucleofection or viral transduction. These methods are typically associated with high cytotoxicity, strong cell type dependency, high risk of chromosomal integration and notable off-target effects. Nuclease protein-based gene editing can nevertheless largely eliminate all the above disadvantages. In previous studies, we have successfully employed purified ZFN, TALEN and Cas9 proteins to induce genomic modifications in a wide range of cells including primary and stem cells. In this project, we intend to further optimize this gene-free gene editing technologies. Specifically, we plan to further increase the gene-editing efficiency, decrease cytotoxicity and investigate the clinical-scale treatment of primary and stem cells, aiming to pave the way for the therapeutic application of nuclease proteins.

随着ZFN、TALEN及CRISPR/Cas9等基因编辑技术的不断成熟，应用核酸酶对遗传疾病进行的基因治疗逐渐成为人们关注的焦点。在传统的基因治疗中，编码核酸酶的基因通过脂质体转染、核转染及病毒侵染等方式被运输到细胞中去。这些细胞运输方式往往伴随着细胞毒性高、细胞类型依赖性强、外源基因易整合及“脱靶”效应高等缺点。而基于纯化核酸酶蛋白质的基因编辑技术，则可以极大程度上克服上述这些缺点。之前研究中，我们应用纯化的ZFN、TALEN及Cas9蛋白质对包括原代细胞及干细胞在内的多种类型细胞成功进行了基因编辑。此项目中，我们将进一步优化基于核酸酶蛋白质的“绿色”基因编辑技术，提升此技术的效率、降低细胞毒性并探索对原代细胞及干细胞的放大量处理条件，为今后临床应用奠定基础。

2012年Carlos Barbas课题组首次报道了采用纯化ZFN蛋白质进行的基因编辑。相比采用DNA或mRNA实现的基因编辑技术而言，核酸酶蛋白质能在更多细胞中实现高效基因编辑，并可降低基因编辑的脱靶效率，从而提升基因编辑的特异性。此技术被迅速应用于TALEN、CRISPR-Cas、碱基编辑器（Base editor）等基因编辑工具上。项目负责人于2015年以第一作者、共同通讯作者身份公布了蛋白质介导的基因编辑技术的方案细节（Liu et al., 2015, Nat Protocols）；截止至本项目结题，PubMed上采用技术的文章已超650篇（关键词“Genome editing, Protein delivery”进行检索）。此技术方案对基因编辑领域具有重要影响，特别是对治疗相关等基因编辑应用。.本项目对ZFN、TALEN及Cas9三类核酸酶基于蛋白质的基因编辑技术进行了优化，研究内容主要包括两方面：1. 阐明影响基因编辑效率和特异性的条件或因素；2. 将优化后的技术方案应用于治疗相关基因编辑。对ZFN、TALEN及Cas9分别取得如下进展：1. 采用纯化的ZFN蛋白质可对CD4+ T细胞的CCR5基因实现高效（~40%）基因敲除，而经过编辑的细胞对HIV-1感染具有明显抵抗；2. 采用纯化的TALEN蛋白质可靶向T细胞中的潜伏HIV-1，并高效抑制病毒激活；3. 采用纯化的Cas9/sgRNA复合物可在mdx小鼠（杜氏肌肉萎缩症模型）上实现高效外显子剪切，从而回复Dystrophin蛋白表达，实现治疗目的。.本项目完成过程中，项目负责人以通讯作者身份发表科研论文7篇，包括J Control Release (IF = 7.9)，Genome Biol (IF = 14.0) 等国际一流期刊上的重要成果；以第一完成人身份申请专利6项，包括3项PCT专利。