产油酵母利用挥发性脂肪酸合成微生物油脂的代谢调控策略与机制

Volatile fatty acids (VFAs), derived from organic wastes, can be used as culture media for oleaginous yeasts to produce microbial lipids aiming at realizing the resource recovery and biosynthesis of high value-added bioproducts. However, large-scale application is restricted mainly due to less biosynthesis of microbial lipids and lower bioconversion ratio of mixed VFAs. In this study, oleaginous yeasts are studied in utilizing different ratios of VFAs as the carbon source under nutrients-limited condition. The characteristics and kinetics of microbial growth and lipid accumulation will be investigated focusing on the correlations among the composition of VFAs, C/N ratio, C/P ratio with the composition of microbial lipids. To enhance the biosynthesis of microbial lipids, metal ions are firstly introduced to increase the ability of oleaginous yeast in tolerance, utilization and bioconversion of VFAs. On the other hand, the intermediate metabolites are used in promoting the supplement of acyl-CoA which is directly involved in lipids synthesis. Based on the interaction effect of the metal ions with metabolites, a strategy for the regulation of VFAs utilization by oleaginous yeasts will be proposed. Afterwards, the metabolic regulation mechanism will be elucidated by the analysis of VFAs transformation route, metabolism network as well as protein proteomics. Furthermore, the regulation scheme will be constructed in utilizing typical waste-derived VFAs solution for microbial lipids synthesis.

产油酵母利用有机废物发酵产酸主要产物——挥发性脂肪酸(VFAs)合成微生物油脂能够同时实现废物资源化与高附加值产品合成，然而混合VFAs利用率低且向微生物油脂转化率不高，限制了该技术规模化应用。本研究考察产油酵母利用典型比例VFAs过程中产油酵母生长特性、产脂特性及相关动力学，建立VFAs、碳氮比、碳磷比与微生物油脂组成的相关性；在此基础上重点研究金属离子强化产油酵母活性促进VFAs利用，强化代谢中间产物——酰基-CoA供应促进微生物油脂合成，以及两者综合作用促进产油酵母利用VFAs合成微生物油脂的调控方案；进一步通过VFAs的代谢流向分析、代谢路径关键节点分析以及差异蛋白表达分析，解析调控手段作用下产油酵母利用VFAs合成微生物油脂的代谢调控机制；最后考察调控方案在典型有机废物发酵产酸液合成微生物油脂的适用性，形成有机废物发酵产酸合成微生物油脂的工艺优化策略。

利用有机废物培养产油酵母获得高产量、低成本的微生物油脂是新能源研究领域的重要方向。本课题选择四株产油酵母C. curvatus ATCC 20509， C. curvatus MUCL 29819，L. starkeyi AS 2.1560，R. toruloides AS 2.1389为对象开展了VFAs为碳源合成微生物油脂的研究。针对低浓度VFAs，建立了序批式培养模式(SBC), VFAs中乙酸:丙酸：丁酸比例为6:3:1时，油脂含量和油脂产量最大达到42.7%和1.77g/L，磷限制能够进一步提高单不饱和脂肪酸（C18:1）的含量（49.16%）。针对高浓度VFAs为碳源，提高酵母菌C. curvatus ATCC 20509接种浓度OD600=3.0、N/C=0.016、初始pH9条件下，以30 g/L高浓度混合VFAs为碳源时油脂产量和碳源向油脂的转化效率分别达到4.82 g/L、0.187 g/g；进一步采用脱木质化纤维素固定培养产油酵母，可使生物量和油脂产量提高至12.80 g/L、7.15 g/L(40 g/L乙酸)，单位油脂提取能量输入也由0.30 GJ降至0.18 GJ。相比于驯化胁迫及表面活性剂投加，序批式培养联合磷限制提高胞外油脂产量最高可达1.7 g/L，其可降低油脂提取过程中能量消耗30.8%。在碳代谢流向分析方面，酵母菌利用乙酸、丙酸、丁酸积累油脂时，分别有40%、16%、59%的碳源用于胞内油脂的合成，这与三种VFA代谢路径有关；研究发现当油脂含量大于35%时，胞内NADPH/NADP+与油脂含量呈明显正相关关系，这说明了NADPH对油脂积累的促进作用。在上述研究基础上，建立了预处理-厌氧发酵模式获得发酵产酸液，提出了混凝-酸析-鸟粪石联合调理工艺，通过不同调控手段促使C. curvatus MUCL 29819利用中高浓度乙酸向胞外油脂高效转化；研究结果表明，产油酵母以污泥产酸液为碳源合成胞内油脂是合成生物柴油的理想原料，微生物油脂的脂肪酸组成均以碳链长度为C16~C18的脂肪酸为主，其含量占总量的90%以上。合成的微生物油脂制备的生物柴油的碘值、运动粘度、十六烷值等均符合国家标准，具有良好的燃烧性能。生命周期评价结果表明采用脱水污泥制备生物柴油工艺相比传统柴油制备过程具有明显优势，是制取生物柴油较大潜力的廉价原料。