成骨相关基因多态性与中国北方汉族人群胸椎后纵韧带骨化症的相关性研究及功能验证

Ossification of the posterior longitudinal ligament (OPLL) is the myelopathy caused by heterotopic ossification of the posterior longitudinal ligament. The most common site of OPLL is the cervical spine while thoracic OPLL(T-OPLL) is rare but more severe. The disease has obvious characteristics of ethnic predilection, almost only found in Japanese, Korean and Han people of Northern China. Previous studies have suggested a number of osteogenic gene polymorphisms associated with the occurrence and development of cervical OPLL, but genetic studies for thoracic OPLL are rare. Our previous studies have found significant differences in the natural history of patients with T-OPLL; slow disease progression was seen in some patients, while rapid progression in other patients was noted. This study is based on the Han people of Northern China with T-OPLL, in which their osteogenesis-related genes (including the promoter, exons and introns) will be screened out and tested for potentially relevant genetic polymorphism, which will be analysed for its association with the occurrence, range(disease severity) and disease progression of T-OPLL. By using recombinant plasmid transfection, electrophoretic mobility shift and chromatin immunoprecipitation to take functional verification of the highly relevant promoter region gene polymorphism and using multi-gene co-transfection and mRNA splicing to take functional verification of exon and intron gene polymorphism, we hope to explore the pathogenesis of this disease and search for potential indicators that can help assess disease progression of OPLL.

后纵韧带骨化症（OPLL）是脊柱后纵韧带异位骨化压迫脊髓导致的脊髓病。颈椎多见，发病于胸椎者少但严重。该疾病具有明显种族好发特性，几乎仅见于日本、韩国及中国北方汉族人群。既往研究提示多个成骨相关基因的多态性与该病的颈椎病变发生及发展相关，针对胸椎OPLL的基因多态性研究尚缺乏。我们前期研究发现OPLL患者的自然病程差异极大，部分患者病情进展缓慢，而部分呈快速进展。本研究将在中国北方汉族人群胸椎OPLL患者中，对筛选出的成骨相关基因启动子、外显子和内含子进行测序，寻找潜在相关多态性位点，分析其与OPLL的发生、累及范围（严重程度）、病情进展速度的相关性。采用重组质粒转染、电泳移动漂移及染色质免疫沉淀实验对高度相关的启动子区多态性进行功能验证，并从多基因共转染和mRNA选择性剪切方面对外显子及内含子区多态性进行功能验证，探索疾病的发病机制，寻找评估疾病进展倾向的指标。

后纵韧带骨化症（OPLL）病因不明。既往研究提示成骨相关基因多态性与颈椎OPLL的发生发展相关，尚缺乏针对胸椎OPLL (T-OPLL) 的基因学研究。本研究前期采集了30例中国北方汉族T-OPLL患者的外周血，提取DNA，进行全基因组测序（Whole genome sequencing, WGS），通过生物信息学分析和疾病预测算法筛选与T-OPLL相关的易感基因及位点，并应用Sanger测序进行验证。随后采集100例中国北方汉族T-OPLL患者以及100例年龄、性别与之相匹配的健康对照者外周血标本，进行病例对照研究验证，探讨突变位点在不同组人群中的发生率。通过酶联免疫吸附实验和实时定量聚合酶链反应检测突变基因的表达。构建突变基因位点和野生型基因位点小鼠胚胎成纤维细胞（MT3T3-L1）模型，通过分子生物学实验进一步验证突变位点是否会导致相应基因异常表达，进行成骨诱导后，检测成骨标志物的表达情况。研究结果显示30例患者中，3例患者COL6A1基因rs201153092位点发生了碱基G→A的突变，4例患者IL17RC基因rs199772854位点发生了碱基C→A的突变，均经Sanger测序验证。病例对照研究提示以上两个突变位点在T-OPLL人群中发生率显著高于正常对照人群，进一步说明以上两个突变位点可能与T-OPLL发生有关。在发生突变患者的外周血及组织中，突变位点相应基因表达水平显著高于未发生突变患者。COL6A1基因和IL17RC基因以上两个位点突变后，基因自身表达明显增高；成骨诱导后，成骨标志物ALP的表达显著增高，IL17信号轴中关键蛋白TRAF6和NF-κB蛋白的表达明显增高。本研究结果提示COL6A1基因rs201153092A和IL17RC基因rs199772854A位点突变可能与T-OPLL发生相关。IL17RC基因可能通过IL17信号通路发挥成骨作用，参与T-OPLL中异位成骨的过程。本研究基于全基因组测序，发现了中国北方汉族人群T-OPLL的两个易感基因及多态性位点，对致病基因多态性位点进行初步功能验证，建立成骨分化模型检测突变位点的成骨作用，预测了T-OPLL可能的发病机制。本研究是T-OPLL最早的基因学研究，研究结果有助于我们了解该病的内在发生发展机制，对疾病的早期诊断以及探索除手术治疗以外的其他辅助治疗手段具有重要意义。