新型隐球菌饥饿应答缺陷抑制突变体的筛选及目标抑制基因的功能分析

新型隐球菌（Cryptococcus neoformans）是一种重要的人体病原真菌，主要感染免疫缺陷患者，引起严重的脑膜炎。该菌能在免疫受损病人的肺泡巨噬细胞营养匮乏的环境中长期潜伏，但其存活的分子机制并不清楚。申请人前期的研究发现新型隐球菌VPS41基因功能缺失导致：A）其致病性完全丧失；B）在氮源饥饿环境以及巨噬细胞中的存活率急剧下降；C）在氮源饥饿条件下细胞周期停滞失调，表明VPS41基因在隐球菌饥饿应答反应中起重要作用。本研究：（1）通过筛选抑制vps41Δ 突变株饥饿应答缺陷抑制突变体来克隆和鉴定参与新型隐球菌饥饿应答信号通路的关键基因；（2）通过对克隆的目标抑制基因详细的结构和功能分析来明确目标抑制基因在隐球菌饥饿应答信号通路中的功能。对新型隐球菌在营养逆境下成活机理的深入研究有助于揭示隐球菌在人体巨噬细胞中的潜伏机制，从而为研发高效，低副作用的新颖抗真菌药物提供平台。

本项目的主要研究计划和目标就是克隆和鉴定新型隐球菌Cryptococcus neoformans)中VPS41基因介导的饥饿信号通路的其它关键基因。我们已成功克隆和鉴定了两个参与隐球菌饥饿反应的基因ACT和ICL，完成了该研究项目的总体目标。.隐球菌是一种重要的人体条件致病性真菌，主要感染免疫严重缺陷的患者。隐球菌能在细胞免疫受损病人的肺泡巨噬细胞营养匮乏的环境中长期存活并最终导致严重脑膜炎等中枢神经系统疾病，但其长期潜伏的分子机制并不清楚。已有的研究表明VPS41基因在隐球菌的体外抗饥饿反应、巨噬细胞中的存活及致病性中起关键作用。.为了鉴定参与VPS41抗饥饿反应信号通路的其它关键基因，我们通过数字基因表达谱测序，首次在转录组水平上鉴定了在氮源饥饿条件下隐球菌野生型菌株H99与vps41Δ菌株基因表达的差异。测序结果分析显示，两者中具有显著表达差异的基因有241个，其中在vps41Δ突变株中表达上调的基因有176个，表达下调的基因有65个。对vps41Δ中表达显著下调的基因中的两个候选基因ACT（编码乙酰转移酶）和ICL（编码异柠檬酸裂合酶）进行了进一步研究：（1）利用pACT启动子构建了隐球菌组成型表达载体pKA-ACT和pKA-ICL并通过电击转化分别引入vps41Δ突菌株中来恢复其相当于在H99菌株中的转录水平。抗饥饿试验结果表明ICL和 ACT基因的组成型表达能够显著抑制vps41Δ突变株的饥饿应答反应缺陷表型(氮源饥饿48h, ICL和 ACT基因表达回补株的成活率分别为43.5%和56%，而vps41Δ突变株为15%)。（2）利用基因同源重组定向敲除策略我们分别敲除了H99菌株中的ICL和 ACT基因。氮源饥饿试验结果表明：同H99菌株相比，ICL和 ACT基因敲除突变株在饥饿条件下存活率显著降低，48h氮源饥饿其敲除突变株的的成活率分别为20.5%和9.4%，而H99为80.4%。以上结果表明ICL和 ACT基因在隐球菌的氮源饥饿反应中起重要作用，同时也暗示在隐球菌的饥饿应答信号通路中ICL和 ACT的表达受VPS41的直接或间接调控。深入研究VPS41调控ICL和 ACT基因表达以及ICL和 ACT在新型隐球菌饥饿反应信号通路的功能将有助于揭示该病原真菌在人体巨噬细胞中潜伏的分子机制，从而为研发高效，低副作用的新型抗真菌药物提供平台。