基于Keap1/Nrf2-ARE信号通路探讨虎奶菇多糖纳米硒对对乙酰氨基酚诱导肝损伤的保护作用机制

Our recent study has showed that PTR-SeNPs improved the activity of antioxidase against oxidative stress in cell/liver. PTR-SeNPs significantly ameliorated the acute liver oxidative damage induced by acetaminophen (APAP) in ICR mice. Furthermore, PTR-SeNPs remarkably prevented HepG2 cells from oxidative damage by APAP. Therefore, we aimed to elucidate the molecular mechanism underlying the hepatoprotective effect of PTR-SeNPs, which probably up-regulate the expression of antioxidase through Keap1/Nrf2-ARE signaling pathway. In this study, APAP-induced oxidative liver injure in wild type and Nrf2 gene knockout ICR mice will be prepared. Whole-body fluorescent imaging system, small animal magnetic resonance imaging, real-time PCR and western blot will be conducted to clarify that PTR-SeNPs exhibit hepatoprotective effect by inducing the expression of antioxidase and decreasing ROS generation through Keap1/Nrf2-ARE signaling pathway. Furthermore, fluorescent probe technique, immunoprecipitation assays and siRNA-mediated transcriptional gene silencing will be performed to elucidate the cellular uptake and localization of PTR-SeNPs and the modulation effect of PTR-SeNPs on the Keap1/Nrf2-ARE signaling pathway in HepG2 cells. It will provide scientific basis for the development of liver protectants in clinical.

本课题组前期研制的虎奶菇多糖功能化纳米硒（PTR-SeNPs）能提高机体抗氧化应激能力，显著改善由对乙酰氨基酚（APAP）诱导的小鼠急性肝损伤和HepG2细胞氧化应激损伤，表现出明显体内外保肝活性。项目拟以Keap1/Nrf2-ARE信号通路调控抗氧化酶表达为切入点，探索PTR-SeNPs潜在的保肝分子生物机理。以野生型和Nrf2基因敲除ICR小鼠复制APAP肝损伤模型，采用活体成像系统、小动物磁共振成像系统、Real-time PCR及Western blot等方法，阐明PTR-SeNPs介导Keap1/Nrf2-ARE信号通路，提高抗氧化酶表达，下调体内ROS水平，发挥保肝功效。以HepG2细胞为模型，荧光探针标记、免疫共沉淀、siRNA转染靶基因沉默等技术手段，明确PTR-SeNPs摄入定位和对肝细胞Keap1/Nrf2-ARE信号通路的调控作用，为临床保肝药物开发提供科学依据。

硒纳米（SeNPs）作为一种抗氧化剂，在与氧化应激相关的疾病中具有潜在的应用前景。功能化硒纳米粒子(SeNPs)具有较低的毒性和较高的生物相容性和反应性，有助于提高治疗活性和临床应用价值。本研究旨在阐明虎奶菇菌核多糖-蛋白复合物修饰的SeNPs(PTR-SeNPs)对对乙酰氨基酚(APAP)诱导的C57/BL6小鼠肝脏和HepG2细胞氧化应激损伤的保护作用及其潜在的分子机制。小鼠体内实验结果表明，PTR-SeNPs能显著降低肝损伤小鼠的肝脏指数、血清的ALT、AST、ALP和LDH水平以及肝组织MDA的含量，明显提高肝组织SOD、CAT和GSH-Px的活力和GSH的含量，从而发挥保肝作用，通过MRI和HE染色实验进一步得到验证。蛋白免疫印迹法结果发现PTR-SeNPs能介导Nrf2的核转位，诱导GCLC、GCLM、HO-1和NQO-1的表达，降低肝脏的抗氧化应激。此外，PTR-SeNPs还可通过抑制CYP2E1活性，抑制毒性中间体NAPQI的产生。Nrf2基因敲除小鼠中PTR-SeNPs对APAP诱导肝损伤的保护作用减弱。细胞体外实验结果发现，PTR-SeNPs能改善APAP诱导HepG2细胞氧化应激损伤，显著提高细胞活力，降低培养液中ALT、AST和LDH水平，细胞中MDA含量，提高细胞内SOD、CAT、GSH-Px活性和GSH含量。研究发现，PTR-SeNPs可定位于细胞溶酶体，促进硒蛋白P的合成分泌，磷酸化激活PKCδ，抑制Keap1，促进Nrf2的核转录，从而诱导GCLC、GCLM、HO-1和NQO-1的基因和蛋白表达。此外，PTR-SeNPs可通过抑制CYP2E1，从而减少ROS的产生。综上所述，我们的结果表明PTR-SeNPs可介导PKCδ的磷酸化，激活Keap1/Nrf2-ARE抗氧化信号通路，促进抗氧化解毒酶表达，清除过多的ROS，提高小鼠肝脏和HepG2细胞的抗氧化防御能力，减缓APAP引起的氧化应激损伤。PTR-SeNPs是一种潜在的肝脏保护剂，可作为重要的补硒来源，在营养保健方面具有广阔的应用前景。