一个赤霉素代谢相关水稻半矮化新突变体的基因克隆和功能研究

株高是农作物中最重要的农艺性状之一，半矮杆基因的克隆和功能研究更具有理论和实践指导意义。在籼稻模式品种93-11诱变群体中发现一个半矮化突变体，前期研究表明，形态学呈现赤霉素相关矮化突变体的典型特征；将该基因精细定位到6号染色体上130kb范围内，在候选区间内发现一个GRAS超家族转录因子；经测序发现，该基因的编码区上游发生了两个碱基缺失导致移码突变；初步RT-PCR分析表明，赤霉素合成代谢途径中5个关键基因在突变体中表达量均明显上调。经检索，该突变体为目前尚未报道过的赤霉素代谢相关新突变体。在此基础上本研究对该基因的功能进行系统的研究，主要包括对该基因进行功能互补验证、过量表达分析、基因沉默、启动子表达规律等方面研究，通过对该突变体的赤霉素相关生理学特性进行分析，阐明该基因的功能和作用途径。研究结果将对进一步认识植物体内赤霉素的代谢调控和分子设计育种具有重要意义。

本研究利用源于籼稻模式品种93-11经-射线诱变产生的矮秆突变体（暂时命名为d62（dwarf62）），开展了表型和生理研究以及基因图位克隆与功能分析。研究结果表明D62基因与GA代谢途径相关，并调控植株生长发育的多个性状。主要研究结果如下：.1．正常生长条件下，d62突变体表现出多个异常表型，其中包括植株矮化、叶片变宽、叶色深绿等水稻GA相关突变体的特征。.2．生理学分析表明，d62突变体植株内源GA1的含量明显降低，GA诱导的无胚半粒米粒产生α-淀粉酶的活性明显减弱。 .3．遗传分析表明，d62突变表型是由单隐性核基因突变引起的；D62基因被初定位在水稻6号染色体短臂的SSR标记RM19289和RM19320之间，对应的遗传距离分别为0.7和1.1cM；进一步的精细定位将D62基因框定到标记MM0124和RM19320之间131kb的物理区间内；在131kb的侯选区间内有一注解基因（IRGSP编号：Os06g0127800；TIGR编号：Os06g03710），其编码推定功能为GA应答元件的GRAS蛋白，被认为是D62最佳侯选基因；基因组和cDNA测序结果均表明在d62突变体中该候选基因的ORF区发生两个碱基（GC）缺失造成移码突变；转基因功能互补验证表明将D62基因导入到d62突变体中能回复其突变表型。.4．D62基因编码的蛋白为617个氨基酸，其序列具有GRAS家族蛋白的典型特征。D62与GRAS家族的DELLA蛋白、DELLA-like蛋白和SCR（SCARECROW）蛋白均具有同源性（一致性为33-37%，相似性为49-53%），而DELLA蛋白和DELLA-like蛋白是GA信号传导的抑制因子，SCR蛋白调控植物细胞的非对称分裂。.5．RT-PCR分析和D62基因启动子分析均表明D62基因在水稻的根、茎、叶和穗中均表达，但在根中的表达量稍低。.6．RT-PCR分析和Real-time PCR分析结果表明，在d62突变植株中，GA代谢相关基因OsCPS1、OsKS1、OsKO1、OsKAO和OsGA20ox2/SD1表达量均明显上调，也进一步表明D62参与GA代谢相关途径。