虎奶菇菌核形成的分子机制研究

Lentinus tuber-regium (Fr.) Fr., also known as Tiger Milk Mushroom, is a kind of precious and rare sclerotium-forming mushroom. L. tuber-regium sclerotium has important edible, medicinal and economic values for its bioactive compounds. Up to now, the mechanism of sclerotium formation in Lentinus tuber-regium is still not very clear. In this study, on the basis of the draft genome of L. tuber-regium has been completed, the transcriptomes of mycelium and sclerotium will be constructed by RNA-Seq and de novo assembly and mapping to the reference genomes. Differentially expressed genes will be identified by comparing the expression profilings of mycelium and sclerotium, and functions of some critical differentially expressed genes related to sclerotium formation will be studied by CRISPR/Cas9, RNAi and over-expression techniques. Meanwhile, methylation-specific PCR will be used to investigate the regulation of epigenetic modifications to these critical differentially expressed genes. These comprehensive results will be ultilized to elucidate the molecular mechanism of sclerotium formation. This study could enrich the fundamental theory of growth and development of sclerotium-forming fungi, guide the cultivation practice of L. tuber-regium sclerotium.

虎奶菇（Lentinus tuber-regium）是一种能够形成菌核的珍稀食用菌，其菌核因富含多种生物活性成分而具有重要的食药用价值和经济价值。迄今为止，虎奶菇菌核形成的机制仍不清楚。本项目在虎奶菇基因组草图初步完成的基础上，拟采用转录组测序、从头组装及与参考基因组匹配的方法，构建虎奶菇菌丝体与菌核的转录组图谱，鉴定菌核形成相关的关键差异表达基因，并利用基因编辑、干涉及过表达技术研究这些关键差异表达基因的功能，同时应用甲基化特异性PCR技术研究表观遗传修饰对这些关键差异表达基因的表达调控作用，探讨虎奶菇菌核形成的分子机制，为丰富菌核真菌生长发育的基础理论，指导虎奶菇菌核的生产实践奠定基础。

虎奶菇是一种高温的菌核形成真菌，具有重要的食药用价值和经济价值。目前野生的虎奶菇菌核几尽枯绝，而人工栽培产量较低且不稳定。本研究对虎奶菇的单核体全基因组进行了三代测序和组装注释，得到65个contig，N50为4 292 595 bp，基因组大小为35.82Mb，GC含量为47%，共注释得到12173个蛋白编码基因。对菌丝体与菌核进行了转录组测序，经过GO和KEGG分析发现，在菌丝体向菌核分化的过程中差异表达基因主要富集在糖代谢和氨基酸代谢途径。菌核中有1146个显著上调基因，1249个显著下调基因，其中155个显著富集在氧化还原过程，主要为细胞色素单加氧酶、亚油酸酯9S-脂加氧酶1、 锰超氧化物歧化酶、多功能过氧化物酶等基因，表明它们在菌核形成过程中发挥了重要作用。为了研究这些基因的功能，成功构建了虎奶菇的高效遗传转化体系。克隆了虎奶菇Mn-SOD基因，在大肠杆菌BL21中成功表达出有活性的重组酶，构建了虎奶菇Mn-SOD基因的过表达和RNA干涉载体并进行同源转化，发现过表达转化子比干涉转化子生长较快，对逆境有较强的抵抗能力，且过表达菌株较易形成菌核。研究了DNA甲基化对虎奶菇菌核形成的影响，发现虎奶菇菌丝体和菌核的总体甲基化水平分别为7.94%和9.54%，菌核形成伴随甲基化水平的提高，甲基化差异片段比对到响应抗逆的同源基因或蛋白，说明菌核形成中部分抗逆基因或蛋白发挥了作用。虎奶菇MAPK基因启动子序列含有4个核心启动子区和4个CpG岛，重亚硫酸盐测序分析显示MAPK基因启动子甲基化率低于基因组整体水平。不同胁迫处理下虎奶菇菌丝体长势不同，光照无明显影响，25℃生长稍慢，干旱、盐和氧化胁迫菌丝体的生长显著减慢。除干旱胁迫下甲基化率提高外，其他条件都有所降低。在32 ℃时，虎奶菇更易形成子实体，持续光照下表层会产生大量菌核。高浓度5-氮杂胞苷处理下虎奶菇菌丝体长势变慢，但蛋白含量无明显差异，去甲基化处理后虎奶菇菌丝体更易形成子实体。本研究对虎奶菇菌核形成条件和部分形成机理进行了系统研究，为虎奶菇菌核的高产稳产奠定了初步的理论基础。