从Wnt/β-catenin信号通路研究鹿茸对骨缺损愈合过程的影响

Bone defect healing requires not only material with good bone tissue compatibility，but also needs prominent bioactive factors involved.Treatment of bone defect Using reinforcing Kidney method can accelerate the repair process.Pilose antleas which is the representative of chinese herbs of warming and recuperating the kidney-yang，has the significant effect on bone defect healing. Pilose antler polypeptides is a prominent bioactive factor extracted from Pilose antleas. Both can promote osteoblast differentiation and maturation, increasing bone callus growing ，THose are high consistent with the Wnt/ and -catenin signaling pathway in bone defect healing mechanism. In the previous study,we successfully immobilized pilose antler polypeptides on the carbon / carbon composite artificial bone surface and obtained the ideal effect of bone defect repair. However, the molecular mechanism is still not clear.This study intends to using rat with bone defect and the chondrocytes cultured in vitro as the research object, useing Real-Time PCR, Western blot and morphology of technical means, explore whether antler and antler polypeptide Accelerat bone defect repair through Wnt/ beta -catenin signaling pathway, to reveal the bone defect repair mechanism from the molecular biology level，and provide theoretical support and important experimental verification for Chinese medicine in the treatment of fractures and bone defect, Open up a new way of efficient utilization of rare Chinese traditional medicine.

骨缺损修复不仅需要具有优良骨组织相容性的修复材料，更需骨诱导功能突出的生物活性因子参与。传统医学以补肾为基本大法，治疗骨缺损，可加速其修复。鹿茸作为温肾补阳药物的代表，在此方面疗效显著，鹿茸多肽是鹿茸中提取的具有骨诱导功能的活性物质，两者均具有促进成骨细胞的分化与成熟、增加骨痂厚度等作用，这与Wnt/β-catenin信号通路对骨缺损愈合的调控机制高度一致。项目组前期采用共价接枝的方法，成功的将鹿茸多肽固定于碳/碳复合材料人工骨表面，取得了理想的骨缺损修复效果，然而其分子机制尚不明确。本项目拟以大鼠骨缺损模型和体外培养的软骨细胞为研究对象，采用Real-Time PCR、Western blot 、siRAN及形态学等技术手段，探索鹿茸及鹿茸多肽是否通过Wnt/β-catenin信号通路修复骨缺损，从分子学层面揭示其对骨缺损的修复机制，也为中医药治疗骨缺损、骨折不愈合等提供重要的理论支持。

为了解决目前临床上对于骨缺损修复材料不理想的缺点，本研究充分结合了对C/C、PAP以及HAP三种材料的优缺点，以充分发挥三者优势为目的，在C/C表面构建了一种PDA/PAP/HAP复合涂层。我们以C/C基材为空白对照组，C/C-HAP为阳性对照组，分别开展了体外及体内生物学性能评价。体外实验显示：C/C-PDA/PAP/HAP材料具有较高的细胞粘附率，并且明显促进细胞的增殖，增加细胞内ALP和RUNX2基因的mRNA表达。动物骨内植入实验中，C/C-PDA/PAP/HAP组能够促进缺损修复，加快了骨组织重建。以上结果表明，C/C-PDA/PAP/HAP兼具了HAP良好的骨传导性和鹿茸多肽促进骨生长的特点，具备优异的生物相容性和骨整合性能，是一种较为理想的骨组织替换材料。. 为了研究鹿茸及鹿茸多肽在修复骨缺损中的作用，观察Wnt/β-catenin经典信号通路变化规律，我们通过体内及体外实验来进行验证。我们通过细胞培养及细胞与材料的联合培养，采用基因沉默、Real-Time PCR，Western blot及形态学等技术手段来验证课题假设，结果显示：鹿茸多肽能明显促进MC3T3-E1细胞成骨分化，激活Wnt/β-catenin经典信号通路，并能增加促进骨增殖的基因ALP and RUNX 2的表达。在动物实验方面，我们通过制作骨缺损模型，将动物随机分为（1）空白组、C/C基材组、空白+鹿茸多肽口服组、C/C-PDA/PAP/HAP组，通过不同时间喂养，进行相关对比实验，结果显示：鹿茸及鹿茸多肽能够明显加速骨缺损修复，促进骨缺损区域Wnt/β-catenin相关因子的表达的的表达。. 本研究不仅成功的研制出一种具有生物活性的修复材料：PDA/PAP/HAP仿生复合涂层人工骨，更是首次将中药有效成分作为一种活性材料固定在人工材料表面；不仅观察了该材料修复骨缺损的效果，同时明确了鹿茸及鹿茸多肽促进骨缺损修复过程是通过激活Wnt/β-catenin经典信号来实现。不仅为该材料在骨科临床领域的应用，奠定了良好的理论及实验基础，更扩大了名贵中药的应用范围，开拓了中医药治疗现代骨病的作用机制。