Wnt/β-catenin 信号通路对受力MSCs 骨向分化和牵张成骨的分子调控

Distraction osteogenesis (DO), which is regard as "endogenous bone tissue engineering", is a new technology applied for treatment of craniofacial skeletal deficiency and bony defect. At present, it is not yet clear about the molecular mechanism by which stretched cells translate the mechanical signals into biochemical signals, therefore causing cell proliferation and differentiation, protein synthesis and secretion, as well as new bone deposition. Wnt/β-catenin signaling pathway plays an important role in the regulation of bone growth, development and regeneration. This project intends to observe the spatial and temporal expression of Wnt /β-catenin signaling pathway in DO by in vitro loading stress on MSCs and in vivo animal experiments. First, we detect the expression level of the signaling pathway related factors and bone differentiation markers by methods such as molecular biology and proteomics following blocking and enhancing the expression of β-catenin in stretched cells by use of small interfering RNA and lentiviral overexpression vector respectively. Second, we regulate the gene expression levels of β-catenin by use of the signaling pathway inhibitor and enhancers in vivo. Then we evaluate the effects of regulating the Wnt signaling pathway on the expression of related osteogeneic factors and on distraction callus formation by molecular biology, quantitative histology, imageology and biomechanical methods, thus revealing the key regulatory mechanism of Wnt signaling pathway in DO, and hopefully with such knowledge, we can explore a new strategy to promote the new bone formation and mineralization in DO clinically by intervention of Wnt signaling pathway.

牵张成骨(DO)是用于矫治颅面骨骼发育不足与缺损的一种新方法，被誉为内源性组织工程技术。目前，关于牵张区细胞是如何将力学信号转变为生化信号从而引发细胞增殖分化，成骨蛋白合成及新骨沉积的分子机制并不清楚。Wnt/β-catenin信号通路是调控骨组织生长发育与再生的一个重要环节。本项目拟通过间充质干细胞应力刺激与动物DO实验，观察Wnt信号通路在此过程中的时空表达，利用小干扰RNA和慢病毒过表达载体阻断和增强受力细胞中β-catenin的表达，通过分子生物学和蛋白质组学等方法检测该信号通路相关因子及骨向分化标志物的表达水平。继而用该信号通路的抑制与增强因子来调节动物DO过程中β-catenin的基因水平来影响成骨因子的表达和牵张骨痂的形成，从而揭示Wnt信号通路在DO中的关键调控机制，并为临床上探索通过干预Wnt信号通路来促进DO骨再生的新策略。

牵张成骨(DO)是用于矫治颅面骨骼发育不足与缺损的一种内源性组织工程技术，而Wnt/β-catenin 信号通路是调控骨组织生长发育与再生的一个重要环节。本研究通过检测骨髓间充质干细胞受力状态下以及动物DO过程中Wnt通路和相关分子的表达变化，继而利用该信号通路的抑制因子来调节细胞及动物DO过程中β-catenin 的基因水平来探究对成骨因子的表达和牵张骨痂的形成的影响，从而揭示Wnt 信号通路在DO 中的关键调控机制。本项目按计划完成了主要研究内容，为牵张成骨分子机制的探索提供了依据。.研究成果：1、成功于体外对BMSCs细胞进行机械加力。2、成功建立 SD 大鼠胫骨牵张模型，并获鼠长骨牵张器专利一项。3、体外大鼠BMCs细胞在应力刺激状态下，Wnt 信号通路的 相关分子 Wnt3A、β-catenin、Lrp5与 Lef-1 基因表达显著增强，Runx2 表达以及 ALP 活性也在加力后增强；利用DKK-1抑制Wnt通路后，上述分子表达下降。4、抑制黏着斑激酶FAK的表达进而抑制整合素相关通路分子ILK等的表达后，机械力刺激下的MSCs integrin β1, ALP, 和 Runx2的表达显著下调。5、体内牵张第12天、第19天和固定期第7天利用基因芯片检测各基因表达变化情况，筛选出上调或下调前25位的基因及通路相关基因，Wnt通路及Bmp通路在牵张末期显著激活，而Ihh通路在牵张中期的激活程度高于牵张末期及固定期。6、大鼠胫骨牵张过程中，局部骨痂区通路相关分子Wnt3A、Lrp5、 β-catenin与Lef-1表达上调，Runx2 和 OCN的表达也显著上调；局部添加DDK-1阻断Wnt通路后，β-catenin、 Runx2 和 OCN表达明显受到抑制。扫描电镜及组织学检测证明，加入DDK-1后，牵张间隙存在无序的大量纤维组织， 骨小梁的质量和数量显著低于正常组。7、大鼠胫骨牵张过程中，整合素通路激活相关分子FAK和ERK1/2表达显著上调，通路抑制相关分子Cav1显著下调。抑制FAK表达后，p-FAK, p-ERK1/2, p-JNK 和 p-p38MAPK表达下降，OCN、c-fos等骨形成相关蛋白表达下降，牵张间隙骨小梁数量显著降低。8、锂盐胃饲大鼠的胫骨牵张间隙相比生理盐水组具有较高的骨密度及新骨形成，未发现明显的局部及系统性不良反应。