A型肉毒毒素调控脊髓胶质细胞治疗神经病理性疼痛的作用及其机制

Botulinum toxin type A (BoNT/A) has been used to treat a number of pain conditions including neuropathic pain, but its internal mechanism remains largely unknown. Our previous studies showed that the over expression of glial cells, tumor necrosis factor-ahpha(TNF-α) and voltage gated sodium channels following nerve injury contribute to the mechanism of neuropathic pain. Our preliminary experiments have indicated that subplantar injection of BoNT/A in the ipsilateral hindpaw reversed Lumbar 5 ventral root transection (L5VRT) induced neuropathic pain bilaterally. We assume that BoNT/A may exert its analgesic effect by regulating the activation of glial cells and the expression of TNF-α in CNS. The present study propose to examine the existence of axonal transport of peripherally applied BoNT/A to spinal cord; The mechanism of activation of glial cells and exression of TNF-α regulated by BoNT/A is studied in L5VRT animals. Furthermore, the effect of BoNT/A on the expression and function of sodium channels in dorsal root ganglions is also investigated. The research is expected to reveal the central mechanism of BoNT/A on neuropathic pain, thus provide important theoretical basis for the further application of BoNT/A on treatment of various pain.

A型肉毒毒素（BoNT/A）局部注射对临床多种病理性疼痛疗效显著，但其中枢作用机制尚不明确。我们前期研究表明，外周神经损伤后表达上调的脊髓胶质细胞、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)及电压门控钠通道对神经病理性疼痛的产生和维持有重要意义。通过预实验我们发现，一侧足底注射BoNT/A可迅速减轻腰5前根切断（L5VRT）引起的双侧病理性疼痛症状，且可抑制脊髓胶质细胞的激活和TNF-α的过表达。因此我们设想，BoNT/A可能在中枢神经系统通过调控脊髓胶质细胞激活及TNF-α的释放，发挥镇痛作用。本项目拟在L5VRT疼痛动物模型确认BoNT/A逆行转运至中枢神经系统的作用，研究BoNT/A对脊髓胶质细胞激活及其释放TNF-α的调控机制，并进一步观察BoNT/A对背根神经节中钠通道表达和功能的影响，旨在揭示BoNT/A治疗神经病理性疼痛的中枢机制，为进一步应用BoNT/A治疗各种疼痛提供重要的理论依据。

A型肉毒毒素（BoNT/A）局部注射对临床多种病理性疼痛疗效显著，但其中枢作用机制尚不明确。我们前期研究表明，外周神经损伤后表达上调的脊髓胶质细胞、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)及电压门控钠通道对神经病理性疼痛的产生和维持有重要意义。在此基础上本课题拟进一步研究BoNT/A改善神经病理性疼痛的作用机制。本研究以单侧腰5前根切断（L5 VRT）疼痛动物模型为研究对象，首先拟明确外周应用BoNT/A的镇痛作用，并验证BoNT/A是否可逆行转运至中枢神经系统发挥作用。接下来，应用免疫荧光和Western Blot方法检测BoNT/A注射后对中枢神经系统脊髓背角和背根神经节（DRG）中胶质细胞（主要包括小胶质细胞和星形胶质细胞）激活和表达的影响，进而探究BoNT/A对VRT术后胶质细胞释放TNF-α的影响。最后，从蛋白表达和电生理两方面研究BoNT/A对DRG中钠离子通道的影响。研究结果发现：（1）一侧足底注射BoNT/A可迅速减轻L5 VRT引起的双侧病理性疼痛；免疫组化结果提示BoNT/A可从外周逆行转运至双侧的DRG及脊髓背角，而神经轴突转运阻断剂（秋水仙碱）可阻断BoNT/A的逆行转运；（2）BoNT/A可进一步抑制L5 VRT引起的双侧脊髓背角和DRG中小胶质细胞和星形胶质细胞的大量激活；（3）免疫组化结果提示，BoNT/A注射后可使VRT术后脊髓背角和DRG上TNF-α的表达水平下降，同时ELISA结果也发现VRT术后脑脊液和DRG中本来增多的TNF-α水平发生了下降；（4）Western Blot定量分析表明在BoNT/A注射后不同时间点（注射后第1、7、14天）在 VRT 模型动物注射侧和对侧的DRG神经元中钠离子通道Nav1.3、Nav1.8 的蛋白表达发生下调，同时膜片钳实验也证实功能性钠电流TTX-S、Nav1.8发生下降，电流钳实验结果表明神经元动作电位的发放阈值、发放频率等均发生改变，VRT术后神经元的异常高兴奋性出现回落。本课题研究表明，BoNT/A 可能通过影响胶质细胞的激活而减少了TNF-α的释放，进一步降低了初级传入神经元中与病理性疼痛密切相关的钠通道的蛋白表达和功能性电流，降低了神经元的兴奋性，在中枢神经系统水平发挥其镇痛作用。本研究为进一步应用 BoNT/A 治疗各种疼痛提供了重要的理论依据。