甘遂醋制减毒的物质基础及作用机理研究

本项目基于对甘遂独特药性理论的认识和中医临床采用醋制以解毒降毒、缓和药性的实践，应用现代分离分析技术及生物效应评价方法研究甘遂经醋制后毒性降低的物质基础及作用机理。提出：甘遂醋制减毒存效作用可能是通过化学转化和体内代谢改变了毒效物质巨大戟烷型等二萜醇酯的长链酯结构生成低（无）毒的效应物质而实现的。本项目研究包括：（1）通过整体动物模型、在体肠回流法、胃肠仿生系统及Caco-2细胞实验，考察甘遂毒效部位及毒效代表性物质对胃肠系统的毒性作用及量－毒关系，并研究甘遂醋制前后的毒效变化及毒效物质的转化规律；（2）采用整体动物实验方法研究毒效物质的体内代谢过程，同时在分子水平研究甘遂醋制前后对胃肠水通道蛋白（AQPs）及诱发原癌基因表达的影响。从而揭示甘遂醋制减毒的内在本质，为临床用药的安全有效提供科学依据，为有毒中药科学应用基础研究提供思路与方法等方面的探索。

本项目基于中医临床采用醋制降低甘遂毒性的实践，以现代技术研究了醋制降低甘遂毒性的物质基础及作用机理。以模式生物斑马鱼、小鼠脾淋巴细胞、巨噬细胞、L-O2肝细胞、GES-1胃细胞和IEC-6肠细胞等建立了甘遂毒性评价体系，明确了乙酸乙酯部位为甘遂毒性部位及醋炙能够降低甘遂乙酸乙酯部位的毒性。据此，从甘遂乙酸乙酯部位中分离得到了24个化合物，鉴定了22个，分别为8个巨大戟烷型，3个假白榄烷型，5个三萜型及6个其它类型化合物。毒性评价表明巨大戟烷型二萜类化合物和具有8-烯-7-酮结构三萜类化合物为甘遂毒性成分。采用UPLC-DAD -MSn法分析了甘遂醋炙前后化学成分的整体变化特点，并以UPLC-TQ-PDA技术测定了甘遂醋炙前后毒性成分的量变，表明醋炙后甘遂中毒性二萜和三萜类成分含量均有所下降，据此推测甘遂毒性萜类成分含量的降低与其醋炙减毒具有较好相关性。以流式细胞术、HCS、Real-time PCR等对甘遂醋炙前后乙酸乙酯部位对L-O2细胞毒性作用机制的研究表明醋炙降低甘遂肝毒性的可能机制为通过降低对肝细胞的氧化损伤和线粒体路径的细胞凋亡而实现。以电镜观察、酶与Caspase-3活力测定、表征Bcl-2、NF-B、E-钙粘蛋白和ICAM-1蛋白表达等揭示了甘遂对ICR正常小鼠肝及胃肠系统的毒性作用机制为通过促进细胞异常凋亡和炎症坏死双通路共同造成。醋炙能明显降低对上述通路的毒性。甘遂醋炙前后对小鼠胃肠水通道蛋白AQP2、AQP8表达影响的初步研究表明甘遂的胃肠毒性可能与水通道蛋白的异常表达有关，而醋炙后可减轻该表达的异常，降低毒性。以电镜、流式细胞术、HCS、Real-time PCR、Elisa和Western-blot等揭示了甘遂中典型毒性成分3-O-(2′E,4′Z-癸二烯酰基)-20-O-乙酰基巨大戟二萜醇（EK-06）对L-O2细胞和IEC-6细胞的毒性作用机制与诱导细胞线粒体凋亡路径密切相关。EK-06的水解产物确定为巨大戟二萜醇，其在醋甘遂中明显存在而生甘遂中含量极低，其对IEC-6细胞的毒性明显小于EK-06。据此推测甘遂醋炙减毒的作用机理是其毒性较大巨大戟烷型二萜醇酯类化合物经醋炙水解为毒性较小的醇。本研究亦提示在醋炙过程中加热和醋润两个炮制程序能起到降低甘遂毒性的协同作用。上述研究为揭示甘遂醋炙减毒的内在本质，保证临床用药安全有效提供了依据。