Raf-1在非小细胞肺癌中的作用及Akt2/p70S6K信号通路依赖机制的研究

Raf-1 is an important signal pathway protein. The results of our previous studies revealed that the expression of Raf-1 and its activated form p-Raf-1 increased significantly in NSCLC patients, who were characterized by a poor prognosis. Additionally, down-regulation of Raf-1 by short hairpin RNA (shRNA) in NSCLC cell line A549 inhibited its bioactivities in vitro and in vivo, together with inhibiting the expression of p70S6K and p-p70S6K. Similarly, we also found that the expression of Raf-1/p-Raf-1 and p70S6K/p-p70S6K reduced with the silence of Akt2. Therefore, we could put forward the hypothesis that Raf-1 might play a key role in NSCLC through the signaling pathway of "Akt2/p70S6K". To confirm the effects and regulation mechanisms of Raf-1 in NSCLC, this study intended to compare the biological behaviors of target NSCLC cells with silence or over-expression of Raf-1 by RNA interference (RNAi), while evaluating the values of Raf-1 in the treatment of NSCLC by building up a nude mouse model. Moreover, the regulation mechanism of Raf-1 depending on the Akt2/p70S6K signaling pathway in NSCLC would be established from the correlation analysis of the expression of Akt2, Raf-1 and p70S6K, which would be confirmed by functional experiments with dual intervention methods. We believe this study would provide more evidence of the effects of Raf-1 in NSCLC, opening a new window to the targeted therapies of NSCLC.

Raf-1是一种信号通路蛋白。我们前期研究发现Raf-1及活化形式p-Raf-1在非小细胞肺癌（NSCLC）中高表达，是患者不良预后指标；沉默Raf-1，细胞活性明显受抑，且p70S6K/p-p70S6K表达下降；同时发现抑制Akt2，Raf-1和p70S6K及磷酸化水平也降低。据此推测：Raf-1可能是NSCLC关键蛋白，且可能通过Akt2/p70S6K通路发挥作用。为明确Raf-1在NSCLC中作用和调节机制，本研究拟利用RNA干扰技术比较细胞在沉默和过表达Raf-1前后生物学行为的变化；构建裸鼠移植瘤模型，观察抑制Raf-1在NSCLC治疗中的价值；同时从Akt2、Raf-1和p70S6K表达水平相关性分析三者关系，再予"双干预"方法从"功能学"角度证实，从而确立Raf-1的"Akt2/p70S6K通路"依赖机制。本研究旨在系统探讨Raf-1在NSCLC中的意义，为开发新药提供依据。

背景：非小细胞肺癌（Non-small cell lung cancer, NSCLC）是肺癌主要病理类型。Raf-1作为Raf家族中一个重要的亚型，功能极为复杂。有研究发现，70kDa核糖体S6蛋白激酶（p70S6K）是Raf-1下游的一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，属于AGC 激酶家族，也是Akt通路的重要成员。然而，在NSCLC中Raf-1对肿瘤细胞的功能产生影响是否受Akt、p70S6K调节未不清楚，蛋白之间是否存在相互作用也需要证实。 .. 主要研究内容、重要结果及关键数据：首先在NSCLC细胞株中通过RNA干扰技术过表达Raf-1，发现NSCLC细胞增殖活性增强，凋亡细胞比例减少，G0-G1期细胞减少，G2-M期细胞增加，且会影响体内炎症及免疫相关基因水平的表达。表明NSCLC中Raf-1有促瘤作用，有望成为NSCLC治疗的新靶点。进一步沉默Akt-2，发现NSCLC细胞增殖受到抑制，且凋亡增加，细胞停滞在G0-G1期。在沉默Akt-2的基础上，过表达Raf-1，能部分逆转沉默Akt-2对NSCLC细胞株体内外生物学行为的影响。故在NSCLC中可能存在Akt-2/Raf-1信号通路。进一步稳定抑制Raf-1表达（shRaf1），并加入p70S6K过表达载体，获得抑制Raf1且过表达p70S6K的各组NSCLC细胞株，通过体内体外实验，研究Raf1/p70S6K对NSCLC生物学行为的影响。发现p70S6K过表达可促进NSCLC的增殖，抑制其凋亡，促进细胞周期从G0-G1期进入S期。而在靶向沉默Raf-1基础上过表达p70S6K能逆转部分沉默Raf1对 NSCLC生物学行为的影响。提示Raf-1可能通过进一步作用于p70S6K而影响NSCLC的生物学行为。最后利用NSCLC患者临床样本，分析Raf-1、p70S6K、Akt-2的临床意义，发现各自单独阳性表达与患者不良预后相关，且均为阳性表达时患者的预后最差。通过上述研究，发现并证实了在NSCLC中，Raf-1是通过Akt2/p70S6K通路而发挥作用。.. 科学意义：本项目探索了Raf-1在NSCLC中的分子作用机制，丰富了对NSCLC病理机制的认识，为开发新的NSCLC干预靶点奠定了基础。