狼毒活性成分诱导乳腺癌细胞凋亡的作用及其对PI3K/Akt信号通路的调控

诱导肿瘤细胞凋亡是治疗癌症的关键环节之一。细胞内PI3K/Akt信号转导通路在乳腺癌的发生和发展中起着重要作用，阻断或抑制PI3K/Akt信号转导，可诱导肿瘤细胞凋亡。我们前期研究发现，从狼毒大戟中提取分离的岩大戟内酯B在体外能诱导肿瘤细胞凋亡和影响肿瘤细胞周期各时相的分布，但其确切的分子机制仍不明确。本项目利用体内体外乳腺癌肿瘤模型，观察岩大戟内酯B诱导乳腺癌细胞凋亡的作用。采用实时定量RT-PCR、Western blot、流式细胞术、工具药阻断和siRNA干扰等方法，观察岩大戟内酯B对PI3K/Akt信号通路中关键信号分子PI3K-85、Akt、PTEN、mTOR、eIF4E、CyclinD1和Cyclin E的表达及磷酸化水平的影响，阐明岩大戟内酯B介导该通路诱导乳腺肿瘤细胞凋亡的机理和分子靶点，是对中医"以毒攻毒"理论的升华，为开发我国具有自主知识产权的新药奠定良好的基础。

本项目研究按计划完成了相关内容，并增加了观察岩大戟内酯B对MDA-MB-231细胞粘附和侵袭能力的影响。本项目以人乳腺癌细胞MDA-MB-231和MCF-7乳腺癌荷瘤裸鼠为研究对象，采用MTT法检测细胞活性，AnnexinV-FITC/PI双染法、透射电镜技术、AO/EB双重荧光染色等方法检测细胞凋亡，Fluo-3/AM荧光标记技术检测细胞内钙离子含量，流式细胞术检测线粒体膜电位和细胞周期，实时定量PCR法检测mRNA表达，Western blotting和免疫组化等方法检测蛋白表达，划痕实验检测细胞迁移能力，Transwell小室检测细胞侵袭能力，明胶酶谱法检测明胶酶活性。研究结果显示，岩大戟内酯B具有抑制MDA-MB-231细胞生长、诱导细胞凋亡和周期阻滞的作用。岩大戟内酯B呈剂量依赖性的降低MDA-MB-231细胞内线粒体膜电位和增加细胞内钙离子浓度，促进caspase-3和caspase-9 mRNA表达。岩大戟内酯B可显著诱导MDA-MB-231细胞Cyt-c的释放、上调Bax和下调Bcl-2蛋白表达。岩大戟内酯B可抑制MDA-MB-231细胞cyclinD1和eIF4E的mRNA表达，抑制Akt磷酸化、PI3Kp85蛋白表达和ERK磷酸化，并诱导JNK活化。岩大戟内酯B可能通过Akt与ERK通路诱导乳腺癌MDA-MB-231细胞凋亡，eIF4E沉默可使cyclinD1 mRNA与蛋白表达明显抑制。岩大戟内酯B可抑制荷MCF-7瘤裸鼠的肿瘤体积和重量，诱导肿瘤组织凋亡和细胞周期阻滞。岩大戟内酯B抑制荷瘤裸鼠肿瘤组织中p-PI3K、p-Akt、mTOR、Cyclin D1和Cyclin E蛋白表达，增加PTEN和p-eIF4E蛋白表达。岩大戟内酯B抑制MDA-MB-231细胞与纤维连接蛋白的粘附，抑制MDA-MB-231细胞的运动能力和侵袭能力。岩大戟内酯B可剂量依赖性的抑制MDA-MB-231细胞MMP2分泌和mRNA表达，下调了β1-integrin表达。岩大戟内酯B抑制MDA-MB-231细胞FAK和ERK1/2磷酸化。上述结果部分阐明了岩大戟内酯B干预乳腺肿瘤的作用机制，为进一步开发岩大戟内酯B的临床应用提供了药理学依据。通过本项目的研究培养博士后2人，博士研究生3人，硕士研究生4名，本项目研究结果发表论文8篇，其中SCI收录5篇。