狼毒活性成分调控PI3K/Akt/HIF-1α信号通路抑制乳腺肿瘤血管形成的研究

Tumor angiogenesis is associated with the process of the growth of breast cancer, recurrence, and metastasis. Hypoxia is an essential feature of breast tumor microenvironment and promoter of breast tumor angiogenesis. Inhibition of angiogenesis is an effective treatment method for malignant tumor. We previously showed that 12-deoxyphorbol-13-palmitate can inhibits breast tumor growth and angiogenesis, but the underlying molecular mechanisms remain elusive. Thus, we favor the hypothesis that 12-deoxyphorbol-13-palmitate inhibit VEGF secretion from tumor cells through down-regulation of HIF-1α expression might be mediated by inhibiting PI3K/Akt/HIF-1α signaling pathway. To test this hypothesis, this project use MCF-7 cells in vitro as the study object. We investigated that effect of 12-deoxyphorbol-13- palmitate on the expression of PI3K, p-Akt, TSC1/2, p-mTOR, HIF-1α, VEGF expression, and to clarify molecular targets of the inhibition of tumor angiogenesis by 12-deoxyphorbol-13-palmitate. In addition, this project further clarify connotation of combat poison with poison, one of theory traditional Chinese medicine, and provide an idea for research on breast cancer therapy.

肿瘤血管的生成伴随着乳腺癌生长、复发和转移等演变的全过程。缺氧是乳腺肿瘤微环境的基本特征和肿瘤血管生长的启动因子，抑制血管生成是一种有效的治疗恶性乳腺肿瘤的方法。我们前期研究发现狼毒活性成分12-去氧佛波醇-13-十六酸酯具有抑制乳腺肿瘤生长和血管生成的作用，但其确切的分子机制仍不明确。我们提出12-去氧佛波醇-13-十六酸酯通过调控PI3/Akt通路下调HIF-1α表达，抑制VEGF分泌，可能是其影响肿瘤血管生成的工作假说，本项目拟在体外观察12-去氧佛波醇-13-十六酸酯对PI3K/Akt/HIF-1α信号通路中关键信号分子PI3K、p-Akt、TSC1/2、p-mTOR、HIF-1α和VEGF的影响，寻找12-去氧佛波醇-13-十六酸酯抑制肿瘤血管生成的可能作用靶点。本项目为治疗乳腺肿瘤提供新的思路，同时也丰富和创新了祖国医学"以毒攻毒"的科学内涵。

本项目研究按计划完成了相关内容，并增加了免疫荧光化学法检测12-去氧佛波醇-13-十六酸酯对MCF-7细胞HIF-1α蛋白分布及表达影响的研究内容。本项目以人乳腺癌细胞系MCF-7为研究对象，采用MTT法检测细胞增殖，实时定量PCR法检测mRNA表达，ELISA、Western blotting和荧光免疫细胞化学等方法检测白的含量、表达和分布。采用工具药评价了PI3K信号通路在12-去氧佛波醇-13-十六酸酯抑制VEGF分泌中的角色。研究结果显示，12-去氧佛波醇-13-十六酸酯呈时间和浓度依赖性的抑制了MCF-7细胞增殖。12-去氧佛波醇-13-十六酸酯在乏氧条件下呈浓度依赖性的抑制MCF-7细胞中VEGF mRNA和蛋白表达以及培养上清中VEGF含量。12-去氧佛波醇-13-十六酸酯呈浓度依赖性的抑制MCF-7细胞中HIF-1α蛋白表达和核转位，但并没有影响HIF-1α mRNA表达。12-去氧佛波醇-13-十六酸酯显著抑制了乏氧条件下PI3K、Akt和mTOR的磷酸化。12-去氧佛波醇-13-十六酸酯显著诱导了乏氧条件下TSC1和TSC2蛋白表达。通过PI3K抑制剂Wortmannin与12-去氧佛波醇-13-十六酸酯共孵育结果显示，PI3K/Akt信号通路在12-去氧佛波醇-13-十六酸酯抑制VEGF和HIF-1α表达中扮演重要角色。上述结果部分阐明了12-去氧佛波醇-13-十六酸酯抑制MCF-7细胞VEGF分泌的作用机制，为进一步开发12-去氧佛波醇-13-十六酸酯的临床应用提供了药理学依据。通过本项目的研究培养博士研究生2人，硕士研究生2名，本项目研究结果发表论文3篇。