刺参Kisspeptin/GPR54系统特征及其生殖调控机制研究

Reproductive development is a basic physiological process of animals, and the researches focusing on the regulatory mechanisms of this process are of great theoretical value and practical significance. Kisspeptin/GPR54 signaling pathway plays crucial role in the initiation of puberty and leads to sexual maturation through activation of various downstream neuroendocrine factors in vertebrates. However, there is no information revealed on this signaling system and its functions in reproductive regulation of invertebrates. This project focuses on the signaling characteristics and mechanism of Kisspeptin/GPR54 pathway in reproductive regulation of sea cucumber Apostichopus japonicus. Based on full length cDNA cloning of Kisspeptin precursor, pre-obtained and artificial synthesized neuropeptide Kisspeptin, preliminary analysis of GPR54 mediated signal transduction, functional analysis of Kisspeptin/GPR54 system in reproductIve regulation and technical development of A. japonicus somatic cell culture, further studies will utilize the physiological, transcriptomic, peptidomic, molecular and cell biological techniques to clarify the signal transduction mechanisms of A. japonicus Kisspeptin/GPR54 signaling pathway presented by cAMP, Ca2+ and MAPK pathways, and aim to reveal the regulatory functions of this signaling system in reproductive development process. It will help us to understand the essential regulatory role of Kisspeptin/GPR54 mediated signaling pathway in A. japonicus, and enrich the neuroendocrine theory of sexual development control. These finds provide a new understanding on the signal transduction and physiological function of Kisspeptin/GPR54 in invertebrates.

生殖发育是动物基本生理过程，其调控机理研究具有重要理论价值和现实意义。Kisspeptin/GPR54信号通路是脊椎动物生殖发育神经内分泌调控的关键组成，但在无脊椎动物中尚未得以揭示。本项目以刺参为研究对象，在前期Kisspeptin前体肽编码基因克隆及多肽活性鉴定、GPR54介导的信号转导特征分析、生理功能分析、刺参细胞培养系统构建等研究基础上，采用生理学、组学、分子及细胞生物学等研究手段，从Kisspeptin/GPR54信号转导研究入手，结合生理功能研究，综合阐明刺参Kisspeptin/GPR54信号转导特征及分子机制，探明该系统在刺参生殖发育调控中的作用及机理。本项目的实施，将有助于从本质上认识和揭示刺参Kisspeptin/GPR54系统特征及生理功能；将丰富动物生殖发育调控研究理论，获得无脊椎动物Kisspeptin/GPR54信号转导机制和生殖调控功能的新认识。

Kisspeptin信号系统（Kisspeptin神经肽及其受体）是哺乳动物生殖发育神经内分泌调控的关键组成，是下丘脑–垂体–性腺轴（HPG轴）的上游调控元件，参与脊椎动物多种重要生理过程的调节。无脊椎动物的Kisspeptin神经肽及其受体编码氨基酸序列与脊椎动物差异较大，无法通过单一的神经肽或者受体生物信息学分析和功能检测进行判定。因此，本项目以我国重要海洋经济物种刺参为研究对象，运用分子生物学、细胞生物学、生理学等多种研究技术，系统开展Kisspeptin信号系统活性鉴定、功能分析、调控机制研究及进化探讨，取得了如下主要成果：①明确由一个基因编码的刺参两个kisspeptin多肽可以结合并激活两个刺参GPR54受体，并且通过交叉作用活性验证，查明了刺参与脊椎动物kisspeptin信号系统之间的交叉激活特征；②应用人胚肾细胞（HEK293）表达及信号检测平台、刺参组织细胞培养及信号检测平台，判定刺参GPR54偶联的G蛋白类型，阐明刺参GPR54介导的细胞信号转导过程及分子机制，提出高等动物kisspeptin信号系统进化起源于无脊椎动物；③通过周年调查或体内外生理实验等研究手段，系统开展刺参kisspeptin/GPR54系统的生理功能，明确了刺参kisspeptin信号系统在生殖和代谢等生理过程中的作用特征；④预测筛选了刺参NPS/CCAP型肽（NG）、F-like SALMF（FS）、L-like SALMF（LS）等神经肽类激素基因，并检测分析了刺参生殖发育过程中的基因表达变动规律；⑤建立刺参GPCRs数据库并对受体类型进行分型，通过转录组测序比较分析雌性和雄性性腺中特异表达的GPCR基因，解析了参与刺参性腺发育调控的分子通路。项目成果在eLife等期刊发表6篇研究论文，培养硕士研究生6名（4名已毕业）。项目所获得的研究成果为系统解析刺参生殖神经内分泌调控机制奠定基础，并为探讨相关信号系统的分子进化与功能演变提供参考。