基于质谱学和酶活性测定的农药筛查方法研究

This project aims at the new method research on mass spectrometry and enzyme activity assay of pesticide screening study, especially for poorly water soluble organic phosphorus, carbamate two classes of pesticides, and the establishment of high sensitivity, convenient and reliable method for screening of pesticides. The presence of organic medium, two-phase condition is not only beneficial to dissolve in the organic phase and on the interface of two phases of pesticide cholinesterase binding, but also conducive to the cholinesterase enzyme reaction determination. Nanometer material is introduced, to a certain extent, to simulate model of enzyme in intracellular microenvironment. Through introduction of organic medium and nanometer material, we will apply the organic medium and / or nanometer material to the cholinesterase enzyme reaction study, in order to improve the organophosphate, carbamate pesticide on cholinesterase inhibition. In combination with substrate selection, we will make the research of cholinesterase in organic solvent and / or nanometer material under the condition of the existence of biological catalysis and inhibition. Mass spectrometry is used to quantify enzyme reaction product and substrate with high sensitivity and high accuracy of detection. The objective is to obtain the lower detection limit, high sensitive, convenient and reliable screening method for detection of pesticide, which will broaden the thought for detection pesticides in agricultural products, provide technical support for rapid high throughput screening of pesticide residues and lowering the detection limit.

本课题旨在开展基于质谱学和酶活性测定的农药筛查新方法研究，特别针对水溶性差的有机磷、氨基甲酸酯类两类农药，建立高灵敏度、方便可靠的农药筛查方法。有机介质存在下，两相的条件不但有利于易溶于有机相的农药与在分布于两相界面的胆碱酯酶发生结合，而且有利于胆碱酯酶的酶反应测定；纳米材料的引入，在一定程度上模拟酶在细胞内的纳微环境。通过有机介质、纳米材料的引入，将有机介质存在下的酶反应和/或纳微环境的影响因素引入到胆碱酯酶酶反应研究中，以期提高有机磷、氨基甲酸酯农药对胆碱酯酶的抑制作用，结合底物的选择，研究胆碱酯酶在有机溶剂和/或纳米材料存在条件下的生物催化和抑制，并结合质谱进行酶反应产物和底物的高灵敏度、高准确度的分析检测，从而得到更低的检测限，进行高灵敏、方便可靠的农药筛查方法研究，为检测农产品中的相关农药拓宽思路，为快速、高通量筛查相关农药残留，降低检测限提供技术支持。

本课题旨在开展基于质谱学和酶活性测定的农药筛查新方法研究，特别针对水溶性差的有机磷、氨基甲酸酯类两类农药，建立高灵敏度、方便可靠的农药筛查方法。开展了如下方面的工作：1、辅助试剂参与的酶活检测方法高灵敏度地筛查有机磷农药：经过筛选，外加正辛基磷酸能够有效地提高有机磷农药对乙酰胆碱酯酶的抑制作用。在正辛基磷酸存在的情况下，乙酰胆碱酯酶的抑制率仍然可以与农药的浓度之间有很好的相关性；并且，相比于常规的酶抑制方法，检测限可以降低2-3个数量级。2、持久性污染物全氟辛酸对于乙酰胆碱酯酶活性及抑制率的影响：开展了全氟辛酸对乙酰胆碱酯酶活性及抑制率的影响研究。结果发现，全氟辛酸具有提高不可逆抑制剂(有机磷农药)对酶抑制作用的效果。3、人造血浆环境中酶活性反应研究：人造血浆环境中，相比于醋酸铵缓冲溶液环境， 更接近乙酰胆碱酯酶在人体内存在的真实环境，故具有更接近生物体内的蛋白结构，因此具有更高的酶活性。同时，由于蛋白结构的保持，其对一些具有生物毒性的物质（有机磷农药） 反应更为敏感，所以其在人造血浆环境下活性变化率更高，抑制率更为明显。因此可利用人造血浆代替醋酸铵缓冲溶液在乙酰胆碱酯酶酶法检测中的应用，对于一些有机农药的检测，可达到提高检测灵敏度的目的。4、运用ESI-Q/TOF MS定量检测双酶活性：发展了运用ESI-Q/TOF MS定量检测谷胱甘肽硫转移酶和乙酰胆碱酯酶活性的方法。并应用ESI-Q/TOFMS对4种农药中毒的死者及正常人的血液中AChE和GST的活性进行了分析，两种酶的活性变化情况符合前面GC-MS/MS方法得到的结果。5、基于GC-QTOF MS的多农药残留筛选方法的建立：利用保留时间、一级和二级质谱中的代表离子，构建农残的快速筛查通路，最终应用于孕妇及脐带的血清样本，筛查出以有机氯为代表的多个痕量残留农药。6、邻苯二甲酸作为流动相添加剂的游离氨基酸分析方法的建立：采用邻苯二甲酸作为流动相添加剂，建立了亲水相互作用色谱-质谱法测定甲状腺组织中25种游离氨基酸的分析方法。该定量方法成功应用于分析人体甲状腺癌旁正常组织和甲状腺癌组织中的游离氨基酸。本研究的结果将为高灵敏、方便可靠的农药筛查方法研究，为检测农产品中的相关农药拓宽思路，为快速、高通量筛查相关农药残留，降低检测限提供技术支持。