基于拉曼光谱的乳腺癌细胞微钙化形成机制研究

Microcalcifications in the breast are an important indicator for cancer, and often the only early mammographic sign of breast cancer. The processes by which these ectopic microcalcifications form are unknown. Despite the importance of mammary microcalcifications for the early detection of breast cancer and the potential prognostic and biological relevance, little research has been carried out to investigate the molecular mechanisms involved in their formation. To date, no in vitro models of mammary cell mineralisation exist to study the molecular mechanisms involved in this process. Thus, the aim of this study was to establish and characterise a reproducible in vitro model of mammary cell mineralisation by osteogenic cocktail, then analyzed the microcalcifications of breast cancer cells based on Raman spectroscopy, from which the molecular mechanisms underlying mammary mineralisation can begin to be elucidated, and then to explore the realationship between the expression of osteopontin, osteonectin, and bone morphogenic protein 2 in breast cancer cell lines and the formation of breast microcalcifications in these cell lines.

乳腺微钙化灶是早期发现及诊断乳腺癌最重要的征象，对于其形成原因尚没有结论。目前，有关钙相关蛋白与乳腺癌微钙化的关系及微钙化形成机制的研究国内外文献报道甚少。且目前尚没有乳腺癌细胞钙化体外模型的存在，仍然不能确定他们是否由活跃的细胞过程所产生，或者钙化是否是细胞变性的标志。本研究将成骨鸡尾酒添加至乳腺癌细胞系特定培养基中，诱导细胞体外产生钙化，并使用拉曼光谱检测乳腺癌细胞产生的钙化，分析并鉴定所产生钙化的成分及性质，与之前我们在新鲜乳腺组织冰冻切片中检测到的微钙化成分进行对比。根据微钙化的相关拉曼特征，比较乳腺癌细胞产生的微钙化与乳腺癌组织中微钙化的区别与联系，并建立和描述一个可复制的乳腺细胞钙化体外模型。同时将乳腺癌细胞的骨桥蛋白、骨粘连蛋白、骨形成蛋白-2进行基因敲除，探讨乳腺癌细胞这三种钙相关蛋白的表达与微钙化产生的相关性，以从中阐明钙相关蛋白与乳腺癌微钙化的关系及微钙化形成机制。

特定分布于乳腺内的微钙化灶是乳腺癌的一个重要特征，也可能是部分早期乳腺癌的唯一征象，尽管其对早期乳腺癌的诊断、预后等非常重要，但对于微钙化分子形成机制的研究则很少。为此，本项目采用成骨鸡尾酒诱导乳腺癌细胞产生微钙化，建立乳腺癌细胞钙化的体外模型，分析乳腺癌细胞微钙化的拉曼光谱特征，明确了骨桥蛋白在乳腺癌细胞微钙化形成及转移过程中的作用。研究结果表明：骨桥蛋白基因的表达随乳腺癌细胞侵袭性和成骨鸡尾酒的治疗而增加，抑制骨桥蛋白基因可降低癌细胞的钙化形成和迁移能力，且循环肿瘤细胞和肺转移病灶细胞中骨桥蛋白基因表达升高，证明了骨桥蛋白通过OPN-CD44-VIM轴正调控细胞微钙化以及乳腺癌细胞迁移和转移。另一方面本项目分析了乳腺癌细胞微钙化体外模型中骨粘连蛋白和骨形成蛋白-2在乳腺癌细胞微钙化形成过程的作用，构建了乳腺癌细胞骨形成蛋白-2基因过表达稳定株，明确其在微钙化形成过程中的作用机制。在基本完成项目研究目标的基础上，课题组进一步采用TMT定量蛋白质组学技术分析成骨鸡尾酒诱导的乳腺癌细胞微钙化体外模型中蛋白质表达差异变化。我们的研究结果表明钙化相关蛋白-骨桥蛋白、骨形成蛋白-2、骨粘连蛋白在疾病进展的几个关键途径的调节中起着积极的作用，尤其是骨桥蛋白可能成为一个新的治疗靶点，且可以通过评估微钙化状态的变化来准确监测这种治疗的反应。此外，通过探索骨桥蛋白治疗与其对转移进展的影响之间的关系，可以将微钙化状态的改变作为监测转移及疾病进展的标志物。更重要的是，我们的研究对于进一步研究微钙化与乳腺癌转移之间的因果关系，全面了解微钙化的病因及其作为乳腺癌诊断和预后标志物的应用具有重要意义。