宿主E3泛素连接酶TRIM65抑制乙肝病毒复制的作用及机制研究

TRIM family members play an important role in the organism against viral infection, which is one of the current hot topics in virology. We found that TRIM65 inhibits HBV replication at the transcriptional level. Moreover, the inhibitory ability of TRIM65 on HBV replication depends on its RING domain. This project intends to investigate the inhibition of cccDNA transcription by TRIM65 in HBV stable cell lines and to further investigate the inhibitory effect of TRIM65 on HBV in hydrodynamic tail vein injection mouse model, TRIM65 knockout mouse model and HepG2-NTCP cell based infection model. Our project focuses on the molecular mechanism of TRIM65 in inhibiting HBV at following aspects: the induction of TRIM65 by interferon, RNAi sequencing to find the TRIM65 targeted protein, the co-immunoprecipitation and ubiquitination assay to clarify the mechanism of the interaction between TRIM65 and targeted protein and the regulation function of host endogenous expressed targeted protein on HBV replication. Our study could contribute to a deep understanding of the interaction between HBV and host cells, may discover new anti-HBV replication mechanisms and shed new light on new target for antiviral drug development.

TRIM家族成员在机体对抗病毒感染过程中发挥重要作用，是当前病毒学研究热点之一。我们前期发现TRIM65在体外模型中能够在转录水平抑制HBV复制，且TRIM65对HBV复制的抑制能力依赖于其RING结构域。本项目拟通过在HBV稳定细胞系中探讨TRIM65对cccDNA转录的抑制作用，在高压尾静脉注射的小鼠模型、TRIM65基因敲除的小鼠模型以及HepG2-NTCP细胞的感染模型中进一步研究TRIM65对HBV的抑制作用，重点研究TRIM65抑制HBV的机制：①IFN对TRIM65的诱导；②RNA测序寻找TRIM65抑制HBV的中间靶蛋白；③免疫共沉淀及泛素化实验来阐明TRIM65与靶蛋白之间的相互作用机制，并在体外实验中探讨宿主内源性表达的靶蛋白对HBV复制的调控能力。研究的实施有助于深入了解HBV与宿主细胞间的相互作用，并可能发现新的抗HBV复制的机制，为抗病毒药物靶点的研发提供新线索。

HBV感染引起的慢乙型及相关肝病长期危害国民健康。然而，现有抗病毒药物虽可抑制病毒复制、延缓疾病进展，但无法治愈。其根本原因在于 HBV会在感染的肝细胞核内形成cccDNA微染色体，而现有条件很难筛选或设计出能特异性将它清除药物。因此，必须从新角度寻找能够提高慢乙肝治愈的新靶点和新策略。宿主蛋白对维持 HBV 生命周期起至关重要的作用。因此，筛选能够靶向HBV生命周期中间环节的关键宿主蛋白，深入解析其作用机制，能为后续筛选和鉴定潜在的新型药物靶点，开发提高临床治愈率的新治疗策略提供新思路。TRIM家族成员在机体对抗病毒感染过程中发挥重要作用，是当前病毒学研究热点之一。本课题组前期筛选发现TRIM65能显著抑制HBV复制。进一步通过荧光素酶报告基因实验、RNA降解动态变化实验确定TRIM65在转录水平抑制HBV复制。然后利用Crispr-Cas9基因敲除系统将HepG2-NTCP细胞中的TRIM65敲除，发现其敲除后能显著上调HBV感染模型中cccDNA的转录水平。本项目也在高压尾静脉注射的小鼠模型中证明了TRIM65的表达对HBV复制的抑制作用。为进一步探索TRIM65抑制HBV复制的分子机制，课题组利用干扰素处理不同肝癌细胞系，发现TRIM65并不是干扰素诱导蛋白。为寻找TRIM65作用的靶分子，本课题组也在TRIM65过表达的肝癌细胞中进行转录组测序和免疫沉淀质谱鉴定，发现TRIM65与天然免疫关键蛋白TBK1结合，该现象也通过免疫共沉淀和共聚焦实验证实。后续实验发现TRIM65抑制HBV复制的关键机制在于它能促进TBK1活化，从而 激活TBK1的下游信号通路，介导I型干扰素的产生，以上调干扰素诱导蛋白的表达。本项目首次发现并阐明了TRIM65抑制HBV的作用及分子机制，为开发提升慢乙肝治愈率的新策略提供了新视角和技术支撑。通过本项目，课题组发表SCI论文9篇，培养博士研究生7名，项目负责人2019年入选“长江学者”特聘教授。项目总体已经完全达到预定目标。