顽固群（persister）休眠细胞形成机制的单细胞水平研究

Persister is a dynamic subset of clonal bacterial population that often survives after antibiotic treatment even when the drug is at high-dosages. Persister is slow-growing, has a low metabolic activity, and is often regarded as the source of infection relapse and genetic resistance. Persister is a result of actively expressed toxin-antitoxin (TA) modules among different isolates of a bacterium. Lines of evidence confirm persister adaptation under environmental stresses and its dynamics as subpopulations with variable proportions within the population especially under stringent and/or SOS response. We propose that persister, taking a population strategy for survival, represents a subpopulation that is gradually generated from the population in response to stresses and coordinates with other subpopulations. Here, we plan to investigate this bacterial population strategy and to understand how persister cells regulate their genes under variable stresses, using a microfluidic device and micro-cultural methodology. We will use transcriptomic tools to explore molecular details of the population dynamics under stresses and stringent/SOS response and confirm the results with gene knockout and complementary expression.

顽固群细胞是指对抗生素敏感的单克隆细菌群体中，在大剂量、长时间抗生素作用下仍然能够存活的一小部分不生长的休眠细胞。顽固群细胞是造成感染复发和细菌耐药性变异的源头。目前认为顽固群形成的直接机制是高度冗余的毒素-抗毒素模块的主动表达所致，而且是在细胞群体中随机产生的，无需诱导。然而，细菌在压力条件下的严紧反应/SOS反应能够诱导提高顽固群在群体中的比例。根据前期结果本研究提出顽固群细胞是细菌在压力条件下动态产生的各种表型亚群中的一群，存在共同的调控通路。本课题首先通过微流控细胞芯片观察不同压力条件下细菌群体的生长等表型变化和顽固群细胞形成的动态过程；然后应用转录组测序和流式分选技术，对不同压力条件下顽固群细胞及其祖先细胞亚群的转录组动态变化进行比较，重点考查与严紧反应/SOS反应、生长调控相关基因，并通过基因敲除和补充表达验证其功能，确定顽固群细胞形成的关键分子机制和调节基因。

持留菌（顽固群）细胞是指对抗生素敏感的单克隆细菌群体中，在大剂量、长时间抗生素作用下仍然能够存活的一小部分不生长的休眠细胞。持留菌细胞是造成感染复发和细菌耐药性变异的源头，减少持留菌细胞的比例是预防和控制抗生素耐药的关键环节。但是，持留菌形成的关键分子机制尚未明确，本课题计划通过观察不同压力条件下细菌群体的生长等表型变化和持留菌细胞形成的动态过程；然后应用转录组测序技术，对不同压力条件下持留菌细胞及其祖先细胞亚群的转录组动态变化进行比较，发现持留菌细胞形成的关键分子机制和调节基因，并通过基因敲除和补充表达验证其功能。本课题通过研究计划的实施，发现持留菌细胞通过基因表达调控（包括下调TCA循环，参与电子传递链的基因的表达以减少ROS的产生，同时，乙醛酸替代途径激活，清除中和ROS的基因明显上调），降低细胞内的ROS（活性氧）含量，提示这些抗ROS基因在持留菌形成过程中起到重要作用。通过基因敲除技术，失活清除/中和ROS的基因，和/或者抑制乙醛酸和葡萄糖醛酸途径，可以使持留菌的存活率明显下降，证实了这一假设。此外，通过对囊性纤维化患者呼吸道微生物组的荟萃分析，建立细菌物种和微生物组抗氧化压力能力的定量评估，发现易发持留菌的致病菌相对于其他呼吸道常见致病菌和寄生菌具有更高的抗氧化压力能力，进一步证实了抗ROS机制在持留菌形成过程中的作用。本课题的重要科学意义和应用前景在于：截止目前，大多数降低持留菌的研究都采用在“重新唤醒”持留菌以进行有效杀灭的策略，但我们发现抑制细胞抗ROS机制同样可以有效降低持留菌的存活率，为治疗持留菌相关感染提供新的思路和方法。由于抗ROS机制在细菌物种中普遍存在，因此具有广泛的应用前景。此外，定量评估细菌物种和宏基因组抗OS能力的方法，可以用于判断致病菌形成持留菌的能力，以及检测患者感染部位氧化压力，除了囊性纤维化以外，还可以用于其他类似的慢性感染性疾病。