单细胞水平对非小细胞肺癌干细胞的研究

Cancer stem（initiating）cells play an important role in the cancer development and tumor formation,but there are some debates and controversy in the different studies of lung cancer stem（initiating）cells.Our previous study shows 45% cells of A549 are cancer initiating cells on single-cell level.But it remains unkown how many cells can initiate tumor formation on single-cell level and if non-caner stem cells are able to acquire stemness under particular conditions in the non-small cell lung cancer(NSCLC) tissue.In this project, we plan to study the clone formation capability,self-renew capability and tumor formation in nonobese diabetic/severe combined immunodeficient immunocompromised（NOD/SCID） mice to make sure how many cells are cancer stem cells in the NSCLC on single-cell level. To elucidate if the non-cancer stem cells can acquire the capability to initiate a tumor and become stem-like cells under special conditions and key genes involed in the process to explore the new targets for therapeutic consideration and improve the prognosis of NSCLC.

肿瘤干细胞在恶性肿瘤的发生发展中起重要的作用，肺癌干细胞的研究存在标志物及分选技术的争议。我们前期单细胞水平研究发现肺腺癌A549细胞系中45%的细胞是肿瘤干细胞样细胞，但是非小细胞肺癌组织中肿瘤干细胞的比例尚不清楚。本研究拟采用有限稀释方法，在单细胞水平研究非小细胞肺癌组织中细胞克隆形成能力、自我更新能力、侵袭能力、体内成瘤能力，确定非小细胞肺癌组织中肿瘤干细胞的比例；研究肿瘤细胞在乏氧、化疗、放疗等条件下是否重新获得干细胞样特性，及参与此过程的关键基因，以期发现具有临床价值的新靶点，进而提高肺癌治疗效果。

肿瘤干细胞在恶性肿瘤的发生发展中起重要的作用，肺癌干细胞的研究存在标志物及分选技术的争议。我们前期单细胞水平研究发现肺腺癌A549细胞系中45%的细胞是肿瘤干细胞样细胞，但是非小细胞肺癌组织中肿瘤干细胞的比例尚不清楚。在此基础上，我们将新鲜肺癌组织消化吸收，并制备单细胞悬液，单细胞水平测定非小细胞肺癌干细胞比例，发现克隆形成率为9%至32%，具备侵袭能力的比例为13%-38%。10例组织样本分别取5个克隆，有8例可在干细胞培养液中形成肿瘤球并不断传代。在正常培养液中，10例均能不断形成克隆。将肿瘤克隆培养至105细胞后移植至NOD/SCID小鼠皮下，84%能形成肿瘤。非小细胞肺癌中具有肿瘤干细胞特性的细胞占9-38%。放疗、化疗、乏氧均使非小细胞肺癌细胞克隆形成率、侵袭力、生长能力加强，增加了干细胞特性。Western Blot及RT-PCR检测中度乏氧后HIF-1α、ALDH1A1、CD44、CD133、CXCR4、c-Myc、Oct4、Sox2的表达水平变化。发现Sox2可能为驱动肿瘤细胞干细胞特性增强的功能基因。发现Sox2可能为驱动肿瘤细胞干细胞特性的功能基因。miR-145-5降低Sox2的表达使干细胞特性下降。在145例NSCLC标本中检测CD133、OCT-4和Nestin，发现只有Nestin与肺癌患者预后相关。CRISPR/Cas9编辑敲除非小细胞肺癌中Nestin基因，发现集落形成能力及侵袭力下降1倍，凋亡增加1倍。Sox2和Nestin可成为减少或清除肺癌干细胞的靶蛋白。在临床样本中肿瘤干细胞标志物与免疫标志物相关分析，发现CD133表达水平与CD56+NK细胞浸润密度相关，NK细胞有可能靶向肺癌干细胞，增加NK细胞浸润，可改善患者预后。