戊型肝炎病毒的体外培养和病毒结构研究

戊型肝炎病毒（HEV）诱导的戊型肝炎近几年呈上升趋势，由于无稳定的HEV体外培养体系，严重影响HEV的分子生物学研究。本课题将在前期研究基础上，优化细胞系、病毒培养物以及培养条件等，建立稳定的HEV体外培养体系，研究HEV在细胞内的复制、结构、定位、组装以及出胞等分子生物学特征；使用已制备的HEV ORF2和ORF3单抗分别制备亲和层析柱，并分别纯化培养的HEV病毒，在亲和层析基础上，进一步纯化，以期获得适于冷冻电镜观察和蛋白结晶的完整天然病毒颗粒，对其三维机构进行研究；确定ORF3蛋白是否为天然病毒颗粒的组成部分，并研究病毒颗粒中各蛋白的存在形式；采用该培养体系对ORF2和ORF3单抗的中和活性进行分析，研究ORF2蛋白中的中和表位并确定ORF3蛋白是否含有中和表位，为HEV疫苗设计提供借鉴。通过本课题的实施为HEV的分子生物学研究建立稳固的平台。

缺乏稳定的HEV体外培养方法严重限制了HEV分子生物、病毒颗粒结构等相关研究。从HEV 4型攻毒后恒河猴的粪便中选择含高浓度HEV病毒的粪便悬液作为毒种,比较筛选出人肝癌细胞PLC/PRF/5作为培养细胞,通过优化病毒接种量、孵育时间、温度和培养基成份等，在我国首次建立了高效稳定的HEV细胞培养系统，培养效率达到国外同等水平。将培养规模扩大至生产级后出毒水平仍保持不变。高效HEV细胞培养系统的建立，为我国HEV病毒学研究提供了新的技术手段。. 采用电镜、密度梯度超速离心、亲和层析等方法，证明培养上清中HEV颗粒表面存在包膜且含有ORF3蛋白。超速离心发现培养上清中HEV病毒颗粒的密度低于粪便中HEV病毒颗粒。经NP40脱脂处理，培养上清中HEV病毒颗粒密度增大至与粪便相同，透射电镜发现宿主细胞产生的子代HEV病毒具有脂质双层包膜结构。抗ORF3抗体亲和层析表明，培养上清中HEV病毒颗粒含有ORF3蛋白。细胞吸附试验发现包膜不影响HEV与宿主细胞的结合而ORF3蛋白可阻碍病毒与细胞结合。粪便中HEV病毒不含包膜和ORF3，这些结构在HEV经消化道排出过程中被胆汁和消化酶破坏。这些发现颠覆了国际认为HEV病毒为ORF2蛋白包装的无包膜病毒的传统观点。. 采用质谱法、糖蛋白染色和病毒组装试验等对培养上清中ORF2蛋白进行研究。结果表明：HEV病毒颗粒中ORF2蛋白包含ORF2的101-643氨基酸，为糖基化蛋白，可与HEV RNA自行组装为病毒样颗粒并保护HEV RNA免遭RNase A降解。昆虫细胞中表达ORF2蛋白，证明重组ORF2蛋白可自行组装为VLP，VLP的免疫原性强于非VLP结构的ORF2蛋白。为新HEV疫苗的研发提供了理论基础。. 对HEV细胞培养系统进行初步应用：中和试验证明抗ORF2单抗可中和HEV对宿主细胞的感染；基因芯片检测表明HEV感染可导致宿主细胞4个IFN诱导基因表达水平上调；干扰素抑制试验表明500 IU/ml IFN-α2b处理HEV感染细胞1～7天后，HEV复制被抑制；Biacore试验证明HEV可能存在不同的血清型。这部分研究为HEV的防治工作提供了有意义的数据。. 总之，本课题在建立稳定的HEV体外培养体系的基础上，对HEV的病毒结构进行了详细深入的研究，为HEV的疫苗开发和感染防治工作提供了理论依据。