戊型肝炎病毒体外高复制细胞模型优化及病毒三维结构解析和免疫原性研究

Hepatitis E virus (HEV) infection is an emerging health issue worldwide. Epidemics of hepatitis E occur periodically throughout the developing world, resulting in 20 million infection, 3 million cases and 70 thousand deaths per year. Hepatitis E causes dramaticly increasing morbidity and motality than other hepatitis in the decade and is prone to develop chronic infection in immunosuppressed population, leading to liver fibrosis and cirrhosis. However,there is no FAD-approved aniti-HEV medicines and no specific treatment now. The study of HEV structure is long-term hampered due to lack of robust in vitro HEV cell culture system. The recent developed full-length HEV infectious cell culture model enables the virus yield and enrichment in vitro, providing advantage to study HEV structure. In this study, we estabolish and optimize the viral yield on the basis of in vitro nature HEV cell culture system to obtain aboundant and intact viral particle, used for further determining the three-dimensional structures of HEV and identifying the molecular mechanism of viral attaching and entering host cells. Meanwhile, we compare the structrual features between HEV empty particles and mature virons, as well as the structural difference between nature HEV particles and HEV viral like particles reported before. The deeper understanding of the structure of viral particle will offer new insight into HEV foundational research and clinical development, such as detailed process of HEV infection and replication,the pathogenesis of hepatitis E and HEV clinical management, providing new opportunity for development of efficient aiti-HEV strategies. Meanwhile, the development of stable and effective vaccine may be facilitated by parallel progress in the exploring the structure and immunogenic differences between HEV empty particles and mature virons.

戊型肝炎病毒（HEV）诱导的戊型肝炎是近年来全球性新发问题，其病死率远超甲肝，至今没有标准的抗病毒疗法。由于无稳定高效的HEV体外细胞培养模型，天然HEV病毒结构解析受到限制，导致HEV复制感染过程及发病的分子机制尚不清楚，为抗病毒药物等的研究带来困难。本课题将在前期工作已建立和验证的全基因序列天然HEV体外培养模型的基础上，利用病毒转染不同细胞系以及采用不同的病毒培养方法，优化HEV体外产毒系统，以富集纯化获得大量完整的HEV病毒颗粒用于冷冻电镜对其三维机构进行研究，并对比天然HEV空心和实心两种颗粒结构差异、对比天然HEV与此前报道的HEV病毒样颗粒结构的差异。根据病毒衣壳蛋白氨基酸序列、亚单位结构及病毒粒子形态，分析HEV的进化地位。基于HEV单颗粒结构研究其感染宿主细胞和机体免疫机制。同时，首次开展HEV空心和实心两种不同病毒颗粒的免疫原性和抗原性研究，有助于新型高效疫苗的开发。

.本研究构建了戊肝病毒(HEV) 体外高复制感染模型，可持续稳定感染人和动物的多种细胞系。同时利用人源肝脏类器官成功建立了HEV体外复制和感染模型，该模型支持感染的整个生命周期。由于类器官是从多能干细胞或者器官祖细胞生成的，它们分化并自发形成与体内来源组织或器官高度相似的结构，在保持源组织/器官细胞类型的结构、组成、多样性和功能方面具有独特优势，该系统将极大推动戊肝病毒与宿主互作以及抗病毒药物筛选的研究。该项目明确了HEV开放阅读框（ORF）2的蛋白结构信息，在660个氨基酸(AA)残基中，我们鉴定出144个保守位点。通过三维蛋白结构预测和细化，成功构建了43个基于先前提出的参考序列和适应感染克隆的细胞培养模型。域的结构比对揭示了S域和M域的结构守恒。此外，分子嵌合预测了不同基因型间单克隆抗体对ORF2的结合亲和性不同。因此，我们在序列和结构层次上扩展了ORF2的信息。基于HEV体外模型的建立，我们还揭示了HEV激活天然免疫反应及炎症反应机制，并解释了该激活过程所需的天然免疫调节因子。临床研究方面，阐明了基因4型HEV感染与神经系统疾病相关性。通过分析各类非创伤性神经系统损伤中HEV感染率，发现基因4型HEV感染与病毒性脑炎具有相关性。开展了国际上首个针对HEV相关肝衰竭的临床大队列研究，揭示了中国人群戊型肝炎患者发生肝衰竭的流行率、近十年的流行趋势、危险因素及预后，发现肝脏本身肝硬化的状态，而非是否有慢性基础肝病以及病因，是戊肝患者是否发生肝衰竭的重要因素，纠正了既往认为基础肝病均会影响戊肝患者预后的认识，大力推动了HEV相关肝衰竭和死亡风险的早期预警。本项目还首次证实了基因4型HEV感染健康人后导致慢性肝炎的证据。此外我们还探究了同HEV同属单正链RNA肝炎病毒的HCV的隐匿性感染，揭示了慢性 HCV 持续病毒学应答 (SVR) 后时代隐匿性 HCV 感染与持续肝组织损伤相关，提示DAA时代丙肝患者达到 SVR 后持续监测意义重大。