HEV ORF2蛋白在戊型肝炎病毒跨种属传播中的作用

As the morbidity of Hepatitis E increased rapidly, hepatitis E virus (HEV) has become the leading cause of acute viral hepatitis in some regions instead of HAV. In recent years, most of the cases in China were caused by HEV genotype 4(HEV 4),while only a small portion were caused by HEV genotype 1(HEV 1). HEV 4 can infect both pig and human, whereas HEV 1 only caused human infection. However, the reason for the cross-species transmission of HEV 4 and the host restriction of HEV 1 is not clear yet.In this project, we will use Split-Ubiquitin Based Membrane Yeast Two-Hybrid System to screen the cDNA library of human and pig for the host interaction proteins with HEV 1 and HEV 4 ORF2. Three types of proteins will be selected for further study.1) pig proteins interacting with ORF2 of HEV 4 but not HEV 1, 2)Human proteins but not the homolog of pig proteins interacting with HEV 1 ORF2,3)both human proteins and the pig homolog proteins interacting with HEV 4 ORF2. We will verify interaction through classical methods for protein interaction and determine the key region of HEV ORF2 and key host proteins which effect the host difference of HEV infection. Meanwhile, we will confirm our result by seting up stable cell lines or siRNA knock down in live cells.This research is very important for the prevetion of HEV transmission and infection.

戊型肝炎发病率上升明显，在很多地区已超过甲肝成为发病率最高的急性肝炎。近年来我国人群感染的戊肝病毒（HEV）以4型为主，仅少部分为1型。HEV4型既感染人也感染猪，而1型仅感染人。其4型的跨种属传播以及1型的种属限制机制尚不清楚。本课题将采用分裂-泛素的膜蛋白酵母双杂交系统，用HEV1型和4型的衣壳蛋白（ORF2）从人和猪肝细胞文库中筛选相互作用的宿主蛋白，并选择出三类蛋白，即：1）与HEV 4型ORF2结合但不与1型ORF2结合的猪源蛋白；2）与1型ORF2结合的人源蛋白和猪源蛋白的差异蛋白；3）与4型ORF2结合的猪源和人源的相似性蛋白。对三类蛋白采用经典的蛋白相互作用方法在蛋白水平进行验证，在此基础上进一步确定影响宿主差异的病毒关键结构域和主要特异性宿主蛋白的关键结构域。同时，采用建立稳定细胞株以及siRNA干扰等方法在细胞水平进行验证。该研究对预防和控制HEV的传播具有重要意义。

全球每年约2000万人感染戊型肝炎病毒（HEV），近年来我国戊型肝炎发病率上升明显，HEV感染不仅诱发急性肝炎，也可诱发慢性肝炎、肝硬化和急性肝衰竭，已引起广泛关注。我国流行的HEV主要为HEV1型和HEV4型。HEV4型既感染人也感染猪，而1型仅感染人。然而，HEV感染宿主的机制及不同亚型病毒的宿主限制性机制尚未明确。本课题基于分裂-泛素的膜蛋白酵母双杂交系统，用HEV1型和4型的衣壳蛋白（ORF2）从人和猪肝细胞文库中筛选相互作用的宿主蛋白，并经过生物信息学分析以及经典蛋白相互作用方法的验证，建立了相互作用蛋白库。其中HEV1型筛人肝cDNA文库共得37个阳性蛋白，4型筛人文库共得43个阳性蛋白；1型筛猪肝文库共得18个阳性蛋白，4型筛猪文库共得27个阳性蛋白。对其中部分重要宿主相互作用蛋白进行了深入研究，包括相互作用关键结构域的确认、病毒感染细胞机制的研究、病毒感染后信号通路的研究、乙酰化相关的研究等。发现在HEV感染过程中，宿主蛋白ASGPR具有促进作用，而CD63发挥着抑制作用。ORF2蛋白不仅能够通过与TMEM134相互作用调节NFkB通路；还可以与通过HDAC6相互作用，调节HEV的乙酰化及ORF2蛋白的稳定性。此外，还分析了慢性戊型肝炎患者血清和尿液样本中抗原的检出及各标志物的动态变化，发现了尿液中有具有传染性的HEV排出；建立了基于ORF3多肽的能够区分戊型肝炎病毒基因型的酶联免疫方法等。该研究对戊型肝炎病毒的机制研究，病毒防控以及临床诊断具有重要意义。