神经细胞黏附分子在人恶性黑色素瘤细胞伪足形成中的作用和机制

The migration of cancer cells is the prerequisite for successful metastasis, while the formation of pseudopodium is the first step of cell migration. In previous study, we found that neural cell adhesion molecule (NCAM) regulated the pseudopodium formation. However, the mechanism is still unclear. It has been reported that the protein-protein interactions in lipid raft play an important role in the formation of pseudopodium. Thus, we speculate that NCAM regulates the formation of pseudopodium probably by interacting with raft-associated proteins. In this study, we will first determine the role of NCAM in the pseudopodium formation by construction of NCAM deficient cell lines. Next, we will employ immunofluorescence and membrane raft preparation to determine the relationship between NCAM and lipid raft. Then, we will identify potential NCAM-interacting proteins that are closely-related to lipid rafts by immunoprecipitation, mass spectrometry and bioinformatic analysis. Finally, we will reveal the interaction mechanism between NCAM and these proteins by overexpression, siRNA and transfection of mutation plasmids. In conclusion, our research will provide a new insight for the function of NCAM and the molecular mechanism of cancer cell migration.

肿瘤细胞的迁移性运动是肿瘤成功转移的基础，而伪足的形成是起始细胞迁移的前提。在前期工作中我们发现神经细胞黏附分子（NCAM）能调控黑色素瘤细胞伪足的形成，但相关的机制并不清楚。报道显示，不同蛋白在脂筏平台上的相互作用与肿瘤细胞的伪足形成密切相关。因此，我们推测NCAM很可能通过与脂筏上一些蛋白的相互作用调节肿瘤细胞伪足的形成。在本研究中，我们将（1）通过构建NCAM缺失的细胞系，进一步确定NCAM对肿瘤细胞伪足形成的影响；（2）通过免疫荧光、脂筏成分分离等技术确定NCAM与脂筏的定位及从属关系；（3）通过免疫共沉淀、质谱检测及生物信息学分析，筛选鉴定脂筏上与NCAM相互作用调控伪足形成的相关蛋白，并通过蛋白过表达、siRNA及突变质粒转染，阐明NCAM与这些蛋白相互作用的机制。本课题的完成将深化我们对NCAM功能的认识，同时对于阐明肿瘤细胞迁移性运动的分子机制也具有十分重要的意义。

肿瘤细胞的迁移性运动是肿瘤成功转移的基础，而伪足的形成是起始细胞迁移的前提。神经细胞黏附分子（neural cell adhesion molecule，NCAM）属于免疫球蛋白超家族成员，能调控多种肿瘤细胞和骨髓间充质干细胞（bone marrow-derived mesenchymal stem cells，BMSCs）的迁移，但NCAM与伪足形成之间的关系仍不清楚。在本研究中，我们着重探讨了NCAM对人恶性黑色素瘤细胞定向片状伪足形成的影响，并对其作用机制进行了阐述。我们首先通过慢病毒转染技术沉默人恶性黑色素瘤细胞系A375和M102细胞中NCAM的表达，然后利用划痕实验和Transwell迁移实验证实NCAM的缺失降低了细胞的迁移能力。相差显微镜观察细胞片状伪足的形成结果显示，NCAM的缺失明显抑制黑色素瘤细胞定向片状伪足的形成。对其作用机制的研究表明，NCAM缺失后通过抑制脂筏相关信号通路Src/Akt降低肌动蛋白骨架结合蛋白cofilin的磷酸化，促进肌动蛋白骨架的解聚，并最终抑制片状伪足的形成。为全面认识NCAM的功能，我们还探讨了NCAM对小鼠BMSC伪足形成的影响。结果显示，NCAM同样影响BMSC片状伪足的形成，但与其在人恶性黑色素瘤细胞中的作用机制不同。在BMSC中，NCAM缺失后通过β1整联蛋白相关信号通路增强cofilin的磷酸化水平进而影响片状伪足形成。NCAM这种作用机制的差异可能与细胞系背景密切相关，也反映出NCAM调控细胞片状伪足形成机制的多样化。总之，本研究深化了我们对NCAM功能的认识，同时对于以NCAM为靶点的抗肿瘤药物的开发提供了理论基础。