紫花苜蓿LEA蛋白缓解苜蓿铝毒害的作用机制

Aluminum in red soil in South China seriously restricts the growth of alfalfa. The genes expression of alfalfa under aluminum stress were analyzed with Medicago truncatula chip, and multiple LEA genes were found responding to aluminum stress. Four LEA genes were cloned successfully from alfalfa. Analysis of transgenic arabidopsis thaliana showed that these genes could significantly improve the aluminum tolerance of arabidopsis. This project intends to explore the mechanism of LEA expression regulation by promoter analysis. We plan to clear the physiological protection function of LEA on cell activity under Aluminum Stress by transforming over expression vector and RNAi vector to alfalfa, analyzing cell membrane integrity, ROS components and antioxidant system changes, photosynthetic change and aluminum ion distribution of the genetically modified alfalfa. We plan to analyze the protective effect of LEA on the membrane protein, the affinity for metal ions, and the ability to eliminate oxygen free radicals by in vitro system. At the same time, the changes of the secondary structure of LEA are planned to be further analyzed, and the protective mechanism of LEA protein will be clearly defined. The results will reveal the mechanism of LEA protecting plant cells from aluminum toxicity. These discoveries will enrich the theory of LEA protein.

中国南方红壤中活性铝严重制约着紫花苜蓿在南方的生长。申请人成功克隆四个紫花苜蓿LEA基因。转拟南芥证明它们能显著提高拟南芥耐铝性能。本课题拟进行如下实验：①通过LEA启动子连接报告基因转化拟南芥等方法分析LEA对铝胁迫响应的机制；②通过将LEA基因过表达和RNAi干扰的载体分别转入苜蓿单株系，检测铝胁迫下转基因植株生长和各项生理指标，分析细胞膜的完整性、ROS组分与抗氧化系统的变化、光合的变化和铝离子分布的变化，明确LEA蛋白在铝胁迫下对细胞活性的生理保护功能；③利用体外实验体系，通过结合蛋白质组学、生物化学、生物物理学、蛋白结构分析等方法，分析LEA蛋白对蛋白、膜的保护作用，对金属离子的亲和性，和消除氧自由基的能力。同时进一步分析LEA蛋白作用过程中其二级结构发生的变化，明确LEA蛋白的保护作用机制。课题的结果将揭示LEA蛋白保护植物细胞免受铝毒害的作用原因，并丰富LEA蛋白的理论。

前期成功克隆四个紫花苜蓿LEA基因（MsDHN1、MsLEA1、MsLEA2 和MsLEAD-34），转基因拟南芥证明它们能显著提高拟南芥耐铝性能。本项目通过转基因拟南芥、转基因紫花苜蓿和毛状根，结合蛋白体外实验证明四个紫花苜蓿LEA基因显著提高植物对多种胁迫的抗性能力。项目研究了这四个LEA蛋白对逆境胁迫的响应机制，明确了它们保护植物的基本机理：（1）MsDHN1研究发现， MsDHN1可与水通道蛋白（AQP）MsPIP2；1和MsTIP1；1相互作用，影响根尖草酸的分泌和根尖中铝的积累。酵母单杂和凝胶阻滞等实验证明，MsABF2是MsDHN1的上游调控转录因子；（2）MsLEA1研究发现，过表达MsLEA1的苜蓿，其耐铝、耐旱能力明显增加；叶片的光合生理数据显著强于野生型。pull-down和酵母双杂等实验证实MsLEA1蛋白能够与RuBisCO的大链结构蛋白Ms1770互作，并保护转基因苜蓿叶绿体结构完整性；（3）MsLEA2研究发现，转基因实验证明MsLEA2基因可显著增强植物耐铝、耐旱的能力。亚细胞定位发现，该基因编码的蛋白定位于高尔基体，并通过运输囊泡转运到细胞间隙。同时转基因植物中半纤维素2、果胶以及叶片中的蜡质总量明显提高；（4）MsLEAD-34研究发现，MsLEA-D34的过表达可增加植物对渗透和盐胁迫的耐受性，并引起拟南芥提前开花。在拟南芥开花期和苜蓿毛状根中过表达MsLEA-D34可诱导FLOWERING LOCUS T（FT）基因上调表达。酵母单杂和凝胶阻滞等实验证明ABA响应元件结合转录因子MsABF2可直接与MsLEA-D34启动子中的RY元件结合并激活MsLEA-D4表达。这些研究在探索LEA蛋白作用机理机制等方面具有重要的理论价值，并为培育优良抗逆紫花苜蓿新品种奠定基础。