基于TLR2/4与JAK2/STAT3信号通路研究白芍总苷抑制糖尿病肾脏巨噬细胞激活的分子机制

Inflammation plays an important role in pathogenesis of diabetic nephropathy (DN). Macrophage activation was inhibited by genetic deficiency of TLR2, TLR4 or STAT3 or anti-inflammatory and immunosuppressive agents in diabetic model. But clinical safety is yet to be confirmed by gene therapy or inflammatory / immunosuppressive agents in DN. Our preliminary study suggests that TGP can inhibit the diabetic kidney macrophage activation, but the molecular mechanism has not been clarified. We hypothesized that TLR2/4 and JAK2/STAT3 signal pathway was involved to macrophage activation in diabetic kidney, and they exist between crosstalk activation, TGP inhibited macrophage activation in diabetic kidney through the effect of TLR 2/4 and JAK2/STAT3 signaling pathway. By normal mice and TLR2, TLR4 or STAT3 gene knockout mouse diabetes model or in vitro macrophage culture method, this study is to investigate effect of TLR2/4 and JAK2/STAT3 in macrophage activation and effect of TGP intervention in vivo and in vitro high glucose environment. We also investigate that TLR2/4 signaling pathway and JAK2/STAT3 signaling pathway exists crosstalk. This research results can provide a new way for DN anti-inflammatory intervention.

炎症在糖尿病肾病(DN)发病中起重要作用，应用TLR2/4或STAT3基因敲除小鼠糖尿病模型或炎症/免疫抑制剂干预糖尿病模型可抑制巨噬细胞激活，但基因治疗或炎症/免疫抑制剂应用于DN临床安全尚待证实。我们前期研究提示TGP可抑制糖尿病肾脏巨噬细胞激活，但分子机制尚未阐明。我们假设TLR2/4与JAK2/STAT3信号通路参与糖尿病肾脏巨噬细胞激活，并且他们之间存在串话激活，TGP通过影响TLR2/4与JAK2/STAT3信号通路抑制糖尿病肾脏巨噬细胞激活。我们将通过正常小鼠和TLR2、TLR4或STAT3基因敲除小鼠糖尿病模型、体外巨噬细胞培养等方法，了解在体内外高糖环境下TLR2/4信号通路与JAK2/STAT3信号通路在巨噬细胞激活中的作用及TGP的干预影响，以及TLR2/4信号通路与JAK2/STAT3信号通路是否存在串话。本课题研究成果可为DN抗炎干预提供一个新途径。

DN发病机制的研究证实TLR2/4受体和JAK2/STAT3是介导肾脏炎症的主要信号通路。激活后可募集巨噬细胞，开启一系列的炎症反应，加重糖尿病患者肾脏损伤。白芍总苷(TGP)是有效的抗炎药物，其有效活性成分是芍药苷(PF)，因此本研究采用PF作用于链脲佐菌素诱导糖尿病模型和巨噬细胞，从整体，细胞，分子水平观察TLR2/4和JAK2/STAT3信号通路和促炎症因子的变化，并初步了解TLR2/4与JAK2/STAT3信号通路之间的串话激活，探讨TLR2/4与JAK2/STAT3信号通路参与DN发生的作用机制及PF的干预作用。. 体外结果：比较对照组，高糖、AGEs可使iNOS和促炎因子的mRNA水平上调；培养基中促炎因子水平升高；TLR2/4及下游信号通路，p-JAK2、p-STAT3蛋白表达水平升高；增加MCP-1对巨噬细胞的趋化；使M1型细胞百分比增加。TLR2/4基因敲除、JAK2、STAT3基因沉默、PF可抑制巨噬细胞激活效应，PF在TLR2/4基因的敲除、JAK2、STAT3基因沉默基础上可进一步消除巨噬细胞激活效应。同时在TLR2/4基因敲除细胞上观察到高糖、AGEs刺激下的p-JAK2、p-STAT3蛋白表达受到抑制。体内结果：12周末，TLR2/4基因敲除、PF可使模型组升高的肾重/体重及24h尿白蛋白排泄率显著减少。光镜观察PF和TLR2/4基因的敲除可使肾组织的病理改变明显改善。免疫组化显示PF可使CD68、TLR2/4，NF-κB p-65，p-JAK2及p-STAT3表达明显低于模型组。蛋白印迹显示模型组TLR2/4及下游信号通路，p-JAK2与p-STAT3蛋白的表达明显上调，PF组与模型组相比TLR2/4及下游信号通路，p-JAK2与p-STAT3蛋白表达明显下降。PCR结果显示，PF和TLR2/4基因的敲除可使模型组升高的促炎因子和iNOS的表达明显抑制。同时在TLR2/4基因敲除小鼠肾脏中观察到的p-JAK2、p-STAT3蛋白表达受到抑制。 . 体内外实验证实，TLR2/4，JAK2/STAT3信号通路参与糖尿病肾病的发生。PF干预及TLR2/4基因敲除可以抑制上述信号通路的表达，同时体内体外同时观察到TLR2/4基因敲除可使p-JAK2、p-STAT3蛋白表达受到抑制，证实了相关信号通路存在串话表达。