AMPKα2亚细胞定位在氯离子介导心肌缺血再灌注损伤中的机制研究

在上一基金资助下，我们证实AMPKα2磷酸化激活是Cl- - free对抗心肌急性损伤作用的主要机制。为了进一步深入探讨，我们假设由14-3-3η协助AMPKα2磷酸化入核，进而激活PPARα，减少ROS生成而发挥作用。为此，拟用基因克隆及RNAi等技术，构建14-3-3η-RNAi、PPARα、PPARα-RNAi重组腺病毒表达载体，分别转染原代培养的大鼠乳鼠心肌细胞；建立A/R损伤模型及去除细胞外Cl-；用免疫荧光法对细胞内磷酸化的AMPKα2进行定位，用双标记免疫荧光法、免疫共沉淀法（Co-IP）等研究14-3-3η蛋白在AMPKα2从胞浆到胞核的亚定位中的作用，探讨PPARα激活与AMPKα2亚细胞定位的关系及其对ROS生成的影响；并在整体动物实验上加以证实；以求进一步阐明Cl- - free对抗急性心肌损伤时细胞内的信号传递机制、为寻找抗IRI的新方法、新思路，奠定良好的理论与实验基础。

本课题首先证实在心肌缺氧/复氧（A/R）损伤模型中，去除细胞外氯（Cl-）可磷酸化激活AMPKα2并致其从胞浆向胞核迁移，Co-IP检测证实磷酸化的AMPKα2与14-3-3ƞ结合。为探讨磷酸化AMPKα2胞核迁移对抗心肌损伤的作用及14-3-3ƞ对AMPKα2迁移的影响，本课题分别构建了14-3-3ƞ-RNAi、AMPKα2-RNAi重组慢病毒载体并转染至心肌细胞中，结果显示AMPKα2磷酸化激活入核是Cl--free抗心肌A/R损伤的关键环节，并且这一迁移过程是在14-3-3ƞ的协助下完成，当沉默14-3-3ƞ的基因表达，AMPKα2无法进入细胞核，并且Cl--free抗心肌A/R损伤的作用明显消弱。本课题接下来对磷酸化AMPKα入核的作用靶点进行研究，由于前期研究已经发现Cl--free激活AMPKα2致Catalase和Cu-SOD、Zn-SOD表达增加，ROS生成减少，而过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)通过抑制NADPH氧化酶活性、促进抗氧化酶系的生成减少ROS的产量，故本课题构建了PPARα、PPARα-RNAi重组慢病毒载体，分别转染心肌细胞，结果显示当基因沉默PPARα，AMPKα2激活所致的ROS生成减少明显被消弱；而当转染PPARα慢病毒载体致PPARα表达明显升高，同时给予AMPK特异性的阻断剂Compound C，结果显示ROS生成没有明显降低，故表明PPARα是AMPKα2的下游信号分子。动物实验结果进一步证实，当心肌内注射14-3-3ƞ-RNAi慢病毒质粒，同时给予AMPK特异性激活剂AICAR，两周后用Cl--free液体行Langendroff灌流，心肌酶学参数显示LDH、CK值较未注射病毒组明显升高，血流动力学参数也提示LVEDP，LVDP，±dp/dtmax值较未注射病毒组明显下降；而当心肌内注射PPARα重组慢病毒质粒，并给予AMPK特异性的阻断剂Compound C，心肌各功能指标明显下降。因此，本课题的结果证实Cl--free在心肌缺血再灌注损伤过程中激活AMPKα2，在14-3-3ƞ的帮助下使之磷酸化入核，进而激活PPARα，活化的PPARα一方面抑制NADPH氧化酶活性，另一方面增加抗氧化酶系的生成，两方面的作用使ROS的生成下降，从而对抗心肌缺血再灌注损伤。