中药小分子原位质谱成像新技术及在川芎入脑成分研究中的应用

Traditional Chinese medicine on the central nervous system diseases showing the exact effect, especially in the treatment of stroke and neurodegenerative disorders and other major brain disease. But its efficacy of the material and mechanism of action is still little known, the technical method for characterization the spatial distribution of drug in the brain tissue is less. In this project HSCCC+LogP chromatography and imaging mass spectrometry are associated to intact separate absorption components in blood and in situ characterization absorption components in brain for study possible effective components and interaction mechanism of Chuanxiong. Matrix-assisted laser desorption/ionization-imaging mass spectrometry is used to investigate the specific distribution of small molecules from TCM in each field in brain. Focusing on small molecular mass spectrometry imaging technology, including the matrix selection, the composition of the mixed extract solution and spray optimization, building an image of xenobiotic and heme distribution to assess drug penetrate the blood-brain barrier into the brain tissue. On the basis of this, we selected Chuanxiong as the experimental object with the exact curative effect on the central nervous system diseases, and plotted the distribution spectrum of Chuanxiong component in the brain, revealing the small molecule compounds through the blood-brain barrier and its distribution characteristics. The successful implementation of this project will be helpful to the neuroprotective mechanism study of traditional Chinese medicine and drug design.

中药对中枢神经系统疾病显现出的确切疗效，使得中药在解决脑卒中和神经退化失调等重大脑疾病方面的研究受到广泛的关注，但目前对其药效物质及作用机理依然知之甚少，仍缺乏直观表征药物在脑组织内空间分布的技术方法。本项目瞄准学科前沿，拟采用中药入血成分群HSCCC+LogP色谱整体制备方法，和入脑成分群原位质谱成像新技术，原位表征入脑中药小分子的组成和空间分布，化繁为简，逐层揭示中药药效物质的组成。专注于微量入脑成分的高灵敏度成像和最大覆盖率检测的关键技术研究，包括基质的筛选策略，基质溶剂的组成和喷涂的优化；血脑屏障的原位表征和靶标物质的鉴定等；以川芎为模式药物，绘制川芎入脑成分的脑区分布化学谱，揭示通过血脑屏障的小分子化合物及其分布特征，有利促进川芎神经保护作用机制的研究，为其它药物的研究提供借鉴。本项目的成功实施将把神经保护中药药效物质和作用机制研究，及药物的设计筛选推向一个新高度。

基质辅助激光解吸/电离质谱成像 (MALDI-MSI)是一种强大的组织原位分析工具，可用于无标记的脂类、多糖、多肽和蛋白质等化合物的原位可视化和确定它们的丰度和空间分布，而不需要大量的先验信息。中药药效物质具有分子量小（<500Da），组织含量低和难电离的特征，基于MALDI-MSI技术的组织原位表征，通常受到低质量区基质簇峰的干扰，脂类等内源性代谢物的电离抑制，检测灵敏度低。本研究通过筛选在低分子量区背景干净的基质和组织原位化学衍生化的电离增强剂，改善电离效率，实现基于MALDI-MSI的川芎入脑中药药效物质鉴定和空间分布表征。针对传统基质在低质量区基质簇峰干扰的问题，筛选出N-丁基-4-羟基-1,8-萘酰亚胺新基质，解吸和电离小分子化合物和多肽，有效改善MALDI-MSI检测重复性和低分子量区背景干扰；针对氨基特异性标记物吡喃鎓盐对高空间位阻化合物衍生化效率低的问题，研究亲核反应机理，揭示吡喃鎓盐的反应性主要取决于其取代基的位置和类型，设计合成低空间位阻、高反应活性的2,4,5-三苯基吡喃鎓盐，其对多肽和蛋白质水解物的电离效率可提高60 倍；利用高分辨质谱仪MALDI-FTICR建立了脑组织切片中血红素和脂类的高空间分辨分析方法，实现血脑屏障的初步表征和人参皂苷Rg1给药介导的小鼠脑组织切片脂类变化分析；针对内源性神经递质含量低、难电离的特征，优化吡喃鎓盐浓度、溶剂组成、活化剂种类和喷涂程序，建立低离域风险下的特征氨基化合物组织原位衍生化策略，实现小鼠脑组织切片原位神经递质衍生化和空间分辨表征；针对川芎提取物中主要入脑成分洋川芎内酯和酚酸类药效物质分子结构中均含邻二羟基基团的特征，建立了两种在邻二羟基基团特异性引入含永久正电荷的电离增强剂的组织原位化学衍生化策略，1） 2,4,6-三甲基吡啶鎓-4-甲基苯基硼酸衍生化策略，2）NaIO4 氧化、吉拉德试剂 P衍生化策略，并基于优化的MALDI-MSI分析条件，在给药川芎提取物小鼠的冠状和矢状脑组织切片中以每像素 100μm的空间分辨率首次鉴定到在海马和皮质中分布的洋川芎内酯J。建立基于盐析辅助液液萃取技术（SALLE）的组织匀浆液处理方法，验证洋川芎内酯J在海马和皮质中分布。