谷氨酸棒杆菌生物合成尸胺及其代谢调控研究

尸胺是合成工程塑料聚酰胺的重要原料。目前合成尸胺的方法有化学合成法和酶转化法。化学合成法条件苛刻，污染环境；酶转化法过程复杂，成本较高。本项目试图通过导入赖氨酸脱羧酶基因，将谷氨酸棒杆菌的赖氨酸合成途径延长到尸胺，开辟一条由微生物发酵一步合成尸胺的新方法。以高产赖氨酸的谷氨酸棒杆菌为出发菌株，将大肠杆菌cadA基因和cadB基因同时克隆到谷氨酸棒杆菌中高效表达，CadA酶催化赖氨酸脱羧生成尸胺，CadB蛋白将尸胺转运到细胞外，解决谷氨酸棒杆菌既不能合成尸胺、也不能转运尸胺的问题；确立cadA基因和cadB基因的最佳比例；构建高效合成尸胺工程菌；同时建立代谢流平衡模型，并对代谢网络进行定量分析和网络优化分析，计算发酵不同阶段不同途径的代谢流分布，分析尸胺发酵过程中代谢流的迁移，总结代谢流迁移规律，确立关键节点处代谢流分配方案。这种由微生物发酵一步合成尸胺的方法，为规模生产尸胺提供了新途径。

尸胺是合成工程塑料聚酰胺的重要原料，有着广泛的应用前景。尸胺的合成方法主要有两种：一种是以不可再生资源石油为原料进行的化学合成法；另一种是经赖氨酸脱羧酶催化为基础的生物合成法。随着石油资源的日益匮乏以及自然环境的恶化，生物合成法以其绿色、环保、可再生等特点受到广泛关注，并有望取代化学合成法成为未来尸胺的主要生产方式。.首先研究了大肠杆菌赖氨酸脱羧酶CadA和LdcC在谷氨酸棒杆中的表达、尸胺转化和性质，确定ldcC基因用于谷氨酸棒杆菌的尸胺合成与代谢流分析的研究。然后对ldcC基因和cadB基因的密码子根据谷氨酸棒杆菌的密码子偏好性进行了优化，使ldcC基因和cadB基因的表达量分别提高了约56.2%和81.6%。进一步研究了ldcC基因和cadB基因对尸胺合成与转运关系，确立了在重组谷氨酸棒杆菌中ldcC基因和cadB基因以1:1比例的关系为最佳。根据这一比例关系，通过将ldcC基因和cadB基因的转录单元整合到谷氨酸棒杆菌的磷酸烯醇式羧激酶基因pepck位点，同时将重组质粒pXMJ19-coldcC-cocadB转化到该菌株中，构建并筛选出高效合成尸胺的工程菌株CgCB2，工程菌CgCB2的尸胺总产量和分泌到细胞外的产量分别为19.58g/L和18.02g/L，赖氨酸转化率达87.12%。最后进行了该重组工程菌株的代谢流分析，确立了6-磷酸葡萄糖、磷酸烯醇式丙酮酸和丙酮酸是影响尸胺合成的关键节点、提高磷酸戊糖途径和TCA循环是增加代谢流向合成尸胺方向流动的关键措施。以此为依据进行了代谢网络优化和代谢途径改造，敲除了lysE基因、Ncgl1469基因和pgi基因，构建了高产尸胺的工程菌株CgCB5，工程菌CgCB5的尸胺总产量和分泌到细胞外的产量分别为35.46g/L和32.45g/L，赖氨酸转化率达91.26%，分别比代谢网络优化前提高了约81%、80%和4%。.本项目还构建了能分泌表达LdcC的大肠杆菌工程菌，并建立了LdcC的发酵工艺和尸胺的生物转化工艺。按照该转化工艺，在5L发酵罐，尸胺的产量达98.5 g/L，转化率约99%。利用该工艺，在10 m3发酵罐完成工程菌的产酶诱导和转化过程，尸胺产量约96.8 g/L，赖氨酸转化率约97.6%。.这种利用微生物发酵生产尸胺和微生物转化生产尸胺的方法，为规模生产尸胺提供了新途径。