内皮祖细胞通过紧密连接蛋白介导视网膜内屏障的修复机制

Inpairment of inner blood-retina barrier of retinal neovascularization (RNV), follow by edema, exudation and bleeding, result in serious damage of visual function. Endothelial progenitor cells (EPCs) intraocular transplantation could participate in RNV repair, reduce leakage, but the mechanism is not clear. Research shows that the expression and distribution of tight junction protein Occludin and ZO-1 is closely related to the permeability of endothelial cells. This current project sought to study tight junction protein mediates mechanisms of EPCs repair barrier function of RNV. In vitro, EPCs would be isolated and cultivated to single layer, the fluorescein of sodium and protein would be detected, the expression and morphology of Occludin and ZO-1 would be detected using immunofluorescence and transmission electron microscopy. In vivo, establishing oxygen-inducedretinopathy model, using CFSE tracking EPCs vitreous cavity transplantation, using Evans blue angiography to observe and half-quantitative measure the leakage of RNV, using Western Blot and immunohistochemical to detect the expression and distribution of Occludin and ZO-1 in retina. This current project is aimed to clarify the role of tight junction protein in EPCs repairment of RNV, which would lay the experimental foundation for the reconstruction of the retina functional neovascularization.

视网膜内屏障的破坏是视网膜新生血管引起水肿、渗出和出血的最根本原因。我们前期工作证实，内皮祖细胞(EPCs)眼内移植能够到达视网膜，并参与视网膜新生血管的修复。紧密连接蛋白是视网膜内屏障的重要组成，其表达和分布与视网膜血管的通透性密切相关，而EPCs在修复视网膜新生血管时，是否通过形成紧密连接而发挥作用尚未明确。本项目拟通过体外实验检测EPCs单层细胞通透性、紧密连接蛋白的表达和形态；体内实验测量EPCs眼内移植视网膜新生血管模型后新生血管渗漏情况，紧密连接蛋白的表达以及在视网膜的分布，探明紧密连接蛋白在EPCs移植修复视网膜新生血管中的作用，为促进视网膜功能性血管重建提供研究基础。

本项目已按照计划执行。视网膜新生血管（RNV）由于视网膜内屏障的破坏，增加了血管通透性和异常渗漏，是各种缺血性视网膜疾病的共同起因。内皮祖细胞（EPCs）是血管内皮细胞的前体细胞，具有高增殖潜能及内皮特性，是修复损伤内皮的“细胞库”，但其在视网膜内屏障功能形成中的作用及修复机制尚不清楚。本研究从人脐血中分离的单个核细胞，经过培养和扩增成为EPCs，通过检测EPCs单层细胞对荧光素钠、蛋白的通透性，证实EPCs能够在细胞水平形成与视网膜微血管内皮细胞相似的屏障功能，且随培养时间延长这种屏障功能逐渐增强。免疫荧光染色证实EPCs能够表达紧密连接蛋白Occludin和ZO-1两种蛋白。透射电镜观察EPCs能够在细胞水平形成紧密连接的超微结构。体内实验成功建立高氧诱导视网膜新生血管C57小鼠模型，玻璃体腔注射EPCs后，通过ADPase染色和伊文思兰视网膜铺片半定量检测新生血管的渗漏情况，EPCs眼内注射可以减少模型组小鼠RNV的形成，减轻渗漏。利用Western Blot和免疫组化检测视网膜组织紧密连接蛋白，EPCs眼内注射可增加Occludin和ZO-1的两种蛋白的表达，分布于视网膜血管，促进视网膜内屏障功能的形成。本实验通过体外和体内实验明确了EPCs在形成视网膜内屏障功能方面的作用，发现occludin蛋白和ZO-1蛋白在EPCs形成紧密连接过程中的重要作用，EPCs对RNV屏障功能的修复获得了有意义的研究结果，为进一步的深入研究和成果转化奠定了基础。本项目按照计划书的预定目标，课题组进行了三年的持续深入研究，很好地完成了研究任务，已发表SCI论文4篇，培养研究生3名。