茶多酚介导糖尿病内皮祖细胞修复内皮损伤的作用及机制研究

糖尿病内皮祖细胞（EPC）数量及功能均严重受损，导致内皮损伤修复能力减弱，具体机制尚未阐明。PI3K/Akt信号传导通路在高糖培养的EPC增殖、迁移及血管修复中占重要地位。既往我们研究发现基质衍生因子1α及胸腺素β4通过PI3K/Akt/eNOS途径增加EPC数量、抑制凋亡、促EPC迁移；前期实验发现茶多酚抑制体外高糖培养EPC凋亡；目前已证明茶多酚也参与调节内皮细胞PI3K/Akt路径，故我们推测茶多酚通过PI3K/Akt/eNOS路径改善糖尿病EPC增殖及迁移，继而增强损伤修复能力。本项目利用化学抑制剂及siRNA分别抑制PI3K、Akt和eNOS活性，观察茶多酚对体外高糖培养EPC增殖及迁移的影响，了解体内移植EPC及茶多酚长期治疗后糖尿病大鼠颈动脉球囊损伤内皮修复能力。拟阐明茶多酚作用于糖尿病内皮祖细胞的分子机制，为治疗糖尿病血管损伤寻找有效路径，同时拓展茶多酚药用前景。

基础及临床研究表明，糖尿病机体的内皮祖细胞（EPC）增殖、迁移能力受损，且与Akt/eNOS途径密切相关；同时，茶多酚主要成分表没食子儿茶素没食子酸脂（EGCG）具有调节内皮细胞Akt/eNOS通路活性作用，故EGCG可能具有改善糖尿病机体EPC功能，并进而促进内皮损伤修复的作用。我们的课题研究中首先检测了EGCG对于高糖培养下EPC增殖和迁移功能的作用。我们成功分离并培养了家兔外周血晚期内皮祖细胞，经激光共聚焦行DIL-Ac-LDL和FITC-UEA-I双染及流式细胞仪行CD34、KDR等表面标志物鉴定证实为典型EPC。体外研究证实高糖培养72h可损害EPC的增殖和迁移能力，而40μM EGCG共培养可逆转此抑制作用。进一步我们研究了EGCG逆转高糖抑制作用的机制。采用qRT-PCR和western blot法我们发现高糖或EGCG对于EPC的Akt、eNOS基因mRNA表达无明显作用，但高糖可抑制Akt、eNOS蛋白磷酸化，而EGCG可逆转该作用。在体研究也显示出，EGCG 50mg/kg/d灌胃7d可促进颈动脉内皮损伤糖尿病家兔的内皮修复；对糖尿病家兔EPC行体外培养、扩增后再以EGCG（40μM）干预72h后行Dil标记并自体移植仍可促进糖尿病家兔颈动脉内皮修复，且荧光镜检提示新生内皮中含大量标记的EPC，提示EGCG可促进EPC向EC的转化从而促进内皮修复。