小凹蛋白介导紧密连接蛋白降解与缺血性中风早期血脑屏障损伤机制研究

In the pathophysiological process of brain tissue ischemic damage, the blood brain barrier damage is one of the important pathologic processes of cerebral ischemic cascade injury, it has become the focus on the mechanism of cerebral ischemia injury. Now, MMP2/9 mediating tight junction protein degradation is thought to be the key link in the pathological process of the BBB damage, however,it is less known of MMP2/9 rising/activating mechanism in the early stage of ischemic stroke. We explore the effect of Cav-1 cytoplasm inversion mediating MMP2/9 secreting/activating which leads to tight junction protein degeneration in the early BBB damage of ischemic stroke,and search for the new strategy and treatment for cerebral ischemic injury through taking early measurements for BBB injury, by the cellular structure layer, enzyme spectrum analysis, protein imprinting, immune fluorescence of orientation, quantitative PCR and SiRNA interference method.

在脑组织缺血性损伤的病理生理过程中，血脑屏障(BBB)损伤是脑缺血级联损伤的重要病理过程之一，它已成为脑缺血损伤机制研究中关注的主要焦点。目前认为MMP2/9介导紧密连接蛋白的降解是BBB损伤病理过程中的关键性环节,但对缺血性中风早期MMP2/9升高/激活的机制却知之甚少。本项目拟采用亚细胞结构分层、酶谱分析、蛋白印迹、免疫双标共定位、定量PCR、SiRNA干扰等方法，探讨Cav-1胞浆转位介导MMP2/9分泌/激活导致紧密连接蛋白claudin-5、occludin 和Zo-1降解这一过程，在缺血性中风早期BBB损伤机制中的作用，探索通过干预早期BBB损伤为脑缺血损伤的治疗提供新的策略和方法。

项目背景：在脑组织缺血性损伤的病理生理过程中，早期血脑屏障损伤是脑缺血级联损伤的重要病理过程之一，也是缺血早期溶栓治疗出血转化的重要机制， MMP2/9介导紧密连接蛋白的降解是BBB损伤病理过程中的关键性环节,但对缺血性中风早期MMP2/9升高/激活的机制尚不清楚。.研究内容：建立MCAO大鼠模型，在脑缺血12小时内的6个时间点，通过伊文思蓝染色观察缺血后血脑屏障通透性改变，免疫组化染色、蛋白印迹、原位酶谱、RT-PCR等技术检测总体脑组织及各亚细胞结构Cav-1、MMP-2、MMP-9、claudin-5、occludin和 ZO-1蛋白的表达变化。.重要结果和关键数据：研究发现在大鼠缺血性脑损伤中，（1）缺血后3h，MMP-2的表达水平开始升高，并持续增高至缺血后12h，MMP-9的表达在缺血后4.5h内无明显变化，缺血后9h表达明显升高，缺血后12h升高更加明显；（2）缺血后3h，occludin蛋白的表达水平明显降低， ZO-1蛋白在缺血后4.5h也出现明显降低， occludin和 ZO-1蛋白表达均持续降低至缺血后9h，在缺血后12h，occludin和 ZO-1蛋白表达均有回升；而claudin-5蛋白在4.5h内均未出现表达下降，至缺血后9h，claudin-5蛋白表达才出现明显降低，缺血后12h降低更加明显；（3）缺血4.5h内，缺血脑组织中Cav-1的总体表达无明显变化，而缺血后3h，脑组织胞浆中的Cav-1表达明显上调，同时细胞骨架上的Cav-1表达明显降低，缺血后4.5h，变化更加明显；缺血后6h，Cav-1在总脑组织中的表达出现明显升高，并持续升高至缺血后12h。提示脑缺血早期Cav-1从细胞骨架向胞浆转移，可能介导了MMP-2的表达上调，进而导致occludin和 ZO-1蛋白的降解，MMP-9和claudin-5蛋白在缺血极早期未出现变化，而Cav-1在缺血6h后的持续升高介导MMP-2/9表达上升导致claudin-5蛋白的降解，可能是缺血早期后阶段血脑屏障损伤的主要机制。.科学意义：探讨了Cav-1在缺血早期血脑屏障损伤中介导紧密连接蛋白降解损伤血脑屏障的机制，为探索缺血性中风的早期干预方法寻找新的途径，并为进一步研究缺血性卒中早期溶栓出血转化的防治方法提供新的思路。