DAB2IP基因对电离辐射后DNA损伤应答修复的影响与作用机制研究

DAB2IP is a newly reported tumor suppressor gene. ATM and DNA-PK are the key proteins of radiation-induced DNA damage repair pathway (DDR), respectively, to start homologous recombination repair (HR) and non-homologous end joining (NHEJ) . In this study, the temporal and spatial relationship between DAB2IP and DDR post ionizing radiation (IR) will be discussed on three levels: in vitro, in vivo and clinical specimens: 1) establishing cell and animal models by RNA interference and the target gene transfection technique to decrease and increase DAB2IP expression, respectively. 2) Detecting ATM and DNA-PK and their phosphorylated products under γ-ray of 2Gy with Western Blot (WB). KU-55933 and NU7026 are used to inhibit ATM and DNA-PK activity, colony formation assay and growth curve analysis are applied to evaluate in vitro and in vivo sensitivity to IR. 3) When treated with KU-55933+IR, ATM downstream effector proteins (KAP-1, etc., and the phosphorylated products) and RAD51 foci are detected by WB and immunofluorescence assay. Discussing the effect of DAB2IP on ATM-dependent HR pathway. 4) Collecting specimens of the normal epithelium, benign hyperplasia and cancer tissue, DAB2IP expression are determined by immunohistochemical analysis. Combined with patient history information, the correlation between DAB2IP and the prognosis of radiotherapy are speculated to better understanding the radiobiological features of DAB2IP.

DAB2IP是新发现的抑癌基因，ATM和DNA-PK是DNA损伤应答（DDR）通路的关键蛋白，分别启动同源重组修复(HR)和非同源末端连接(NHEJ)过程。课题拟从细胞、动物和临床三个层面讨论DAB2IP与电离辐射后DDR通路的时空关联：1）以RNA干扰和目的基因转染技术双向调节DAB2IP表达，建立细胞和动物模型；2）γ射线照射后WesternBlot（WB）检测ATM和DNA-PK及磷酸化蛋白，以KU-55933和NU7026分别抑制ATM和DNA-PK，集落和生长曲线法评价模型细胞和动物的放射敏感性；3）KU-55933联合γ射线，WB观察ATM下游效应蛋白（KAP-1等及磷酸化产物），免疫荧光检测RAD51 foci，推测DAB2IP对ATM依赖的HR过程影响；4）收集正常上皮、良性增生和癌组织标本，免疫组化分析DAB2IP同放疗预后的相关性，加深了解DAB2IP的放射生物学功能。

背景：放射治疗是临床实践中肿瘤治疗的主要手段。然而，先天或治疗中形成的辐射耐受，继而引起肿瘤复发，常常是放射治疗预后不佳的主要原因。前期研究发现，DAB2IP 的表达抑制是正常组织同恶变组织相区别的重要生物学特征，那么，DAB2IP是否会影响肿瘤组织的放射敏感性，放射治疗中的辐射耐受又是否与DAB2IP有关呢？研究内容：以前列腺癌和膀胱癌细胞系为研究对象，分别用siRNA干扰和连续分割照射的方法建立模型细胞，mRNA和Western Blot方法检测细胞中DAB2IP的表达；集落形成实验观察不同类型射线（α粒子和γ射线）作用后， DAB2IP对细胞集落形成能力的差异；以射线相关的DNA损伤修复通路入手，Western Blot和免疫荧光方法分别检测DNA损伤修复蛋白表达和DNA双链断裂修复的动态变化，讨论射线与DAB2IP基因表达的相互影响与可能的作用机制。将肿瘤细胞接种于免疫缺陷小鼠，建立动物模型检测DAB2IP对肿瘤放射敏感性的影响。通过临床手术标本，分析DAB2I表达与肿瘤分级分期及治疗预后的相互关联。结果：研究发现，siRNA干扰或分割照射均可以引起肿瘤细胞中DAB2IP表达的抑制，并伴随着细胞对射线的耐受。抑制DAB2IP所引起的ATM的表达增加可能是细胞对射线不敏感的重要原因。抑制ATM的表达可以有效的提高DAB2IP基因沉默的肿瘤细胞对射线的敏感性，作用机制可能涉及DNA双链损伤修复的滞后、NF-κB 和P38MAPK通路的抑制以JNK通路的活跃。长期曝露在电离辐射环境中的肿瘤细胞会对射线产生了耐受，并伴随着DAB2IP mRNA含量的逐渐降低。在耐受的细胞中，可以检测到EGR-1和ATM表达增加，特异性的抑制EGR-1或ATM，可以显著增强射线对细胞的损伤能力。临床研究发现，DAB2IP表达抑制与肿瘤组织分期（P=0.002 ）、分级（P=0.02）、大小（P=0.04）、组织变异（P=0.01）等病理特征显著相关，也与患者预后不良密切相关。结论：DAB2IP的表达抑制可能肿瘤原发性及继发性的辐射耐受有关，ATM是联系DAB2IP与肿瘤细胞放射敏感性的重要生物分子，以ATM为靶点筛选药物可能使提高低表达DAB2IP的肿瘤患者放射治疗疗效的有效手段之一。