Metnase蛋白复合物在电离辐射DNA损伤修复中的作用机制

Ionizing radiation (IR) can induce DNA double-strand breaks (DSBs), which are highly deleterious lesions. The inaccurate repair of DSBs can lead to mutations, chromosome translocations or the generation of repair products that are toxic to the cell. In most cases, cells must choose between non-homologous end-joining (NHEJ) and homologous recombination (HR). This choice has profound consequences for genome integrity, the ability of cells to survive DSBs, and for the role of DSB repair factors (such as BRCA1) in tumor suppression. In human cells, DSB repair pathway choice is under the control of 53BP1, which promotes NHEJ, and BRCA1, which channels DNA ends towards the HR pathway. 53BP1 binds to dimethylated Lys20 of histone H4 (H4K20me2) via its Tudor domains to accumulate at DSB sites. One opinion is that MMSET mediates the dimethylation of histone H4, but which is not supported by all experiments recently released. Metnase, which contain a SET histone methylase domain, was shown to promote DSB repair by NHEJ. However, the detailed mechanism is unclear and it's also unknown whether the function of Metnase is connected to that of 53BP1. We already purified the Metnase complex and identified one associated protein, MIP38. In this project, we will investigate the function of the metnase complex and the relationship between Metnase complex and 53BP1.

电离辐射引起的双链断裂DNA主要由非同源末端连接和同源重组进行修复。错误的选择这两条修复途径，会引起基因突变、染色体异位，导致癌症。细胞如何正确选择这两种途径，一直是该领域最引人关注的问题之一。最新的研究表明53BP1参与了该过程的调控环路，可以促进非同源末端连接。尽管已有研究显示53BP1通过结合MMSET双甲基化的H4K20me2，定位到DNA损伤位点上，但这个观点并没有被普遍证实。Metnase是一个组蛋白甲基化酶，它也可以激活非同源末端连接，但作用机制及与53BP1的关系还不清楚。我们已经纯化了Metnase复合物，并鉴定一个相互作用蛋白MIP38。本课题将首先从新的相互作用蛋白入手，通过生化、分子、细胞手段研究Metnase复合物的作用机制。然后更进一步，用DT40细胞基因敲除系统研究该复合物与53BP1的功能相关性和遗传相互作用，从而解析双链断裂DNA修复途径的选择调控。

Metnase是一个SET组蛋白甲基转移酶和转座酶的融合蛋白。它的甲基转移酶活性可以促进外源DNA的整合，激活细胞对离子辐射DNA损伤的修复，从而维护基因组的稳定性。我们纯化鉴定了Metnase复合物，发现Metnase可以特异的与MIP38相互作用。研究结果表明，Metnase的N端SET结构域能够结合MIP38；MIP38的N端18个氨基酸对于与Metnase的结合是必须的。PRP19（Pso4）是已知的Metnase相互作用蛋白，PRP19可以帮助Metnase定位到DSB位点，从而促进Metnase在DSB修复中的作用。通过MIP38的免疫共沉淀，我们发现MIP38可以结合PRP19，说明这三个蛋白，Metnase，MIP38和PRP19很可能在一个复合物中。此外，通过CRISPR的方法筛选得到Metnase的两个稳定敲除细胞系，电离辐射敏感性实验证实了Metnase是DSB修复所需的。在体外构建了检测Metnase甲基转移酶的体系，发现MIP38不能促进metnase的甲基转移酶活性。这个课题的进行不太顺利，我们尝试了在HCT116细胞和DT40细胞中敲除MIP38，都没有成功，这对于研究MIP38的表型造成了很大困难。. 在本课题进行的后期，我们把研究重心转移到了一个新的DNA修复相关蛋白，ETAA1。复制蛋白A（RPA）复合物作为复制压力应答中的蛋白质支架，在维持基因组稳定性中发挥关键作用。目前已知ETAA1基因的变异与胰腺癌的易感性有紧密关系，但ETAA1蛋白的具体功能仍然未知。实验中，我们鉴定出ETAA1是一个新的RPA复合物结合蛋白，ETAA1序列上包含两个RPA结合的区域，类似于RPA32C结合区域和RPA70N结合的区域。为了应对复制压力的损伤，ETAA1通过以RPA依赖性方式被招募到停滞的复制叉处，并与RPA复合物共定位。缺失掉ETAA1基因会导致停滞的复制叉崩塌，并且会损害复制叉重新起始的效率。此外，上位性分析显示ETAA1稳定停滞复制叉的过程不依赖于ATR通路。综上所述，我们现有的研究结果表明，ETAA1是一个新的RPA复合物相互作用蛋白，能够防止停滞的复制叉崩塌，进而保护基因组稳定性。该工作已经于2016年10月发表于J Biol Chem。