HBXIP与ATM相互作用调控电离辐射致肝细胞癌DNA损伤应答的分子机制研究

Results from our recent studies have shown that hepatocellular carcinoma cells overexpression of HBXIP inhibit ionizing radiation induced-cell apoptosis, and arrest HepG2 cells in G2 phase by activating the G2/M DNA damage checkpoint, which facilite repairing DNA damage induced by ionizing radiation. This project is designed to investigate radiation sensitivity and DNA damage response induced by ionizing radiation in HBXIP overexpressing cancer cells or HBXIP knockdown cells, and to illustrate the mechanisms that HBXIP regulates DNA damage response and downstream protein of ATM (ataxia-telangiectasia mutated) in hepatoma cells while interacting with ATM. Whether the NFκB and PI3K/Akt signaling pathways are involved in the regulation of cancer cells DNA damage response due to HBXIP abnormal expression is also determined in this research. We take combinatory approaches of signal transduction, DNA damage repairing and protein interactions, and a variety of experimental techniques, such as immunopreciptation, confocal microscope and assay of biological response to ionizing radiation,to explore the molecular mechanisms that HBXIP regulates irradiation sensitivity and DNA damage response. Implementation of the project will enrich the roles of HBXIP in the carcinogenesis and radioresistance, and provide theoretical base for identifying new therapeutic targets and combining treatment of cancers.

我们近期研究发现，肝癌细胞高表达HBXIP时可抑制电离辐射诱导的细胞凋亡，促进细胞激活G2/M期DNA损伤检查点，从而有利于修复损伤的DNA。本项目在前期实验基础上，建立稳定高、低表达HBXIP的肿瘤细胞系，检测HBXIP对电离辐射致DNA损伤的影响，探索HBXIP与肿瘤细胞辐射敏感性的内在联系；从HBXIP与DNA损伤感应分子ATM蛋白之间相互作用角度出发，阐明HBXIP对DNA损伤应答过程及ATM下游分子的调节作用；同时探讨NFκB和PI3K/Akt信号通路与HBXIP调控肿瘤细胞DNA损伤应答的相关性。利用免疫共沉淀、激光共聚焦和辐射细胞生物学效应检测等手段，从蛋白质间相互作用、DNA损伤修复和信号传导通路等方面，阐明HBXIP抑制肿瘤细胞放疗敏感性和调控DNA损伤应答的分子机制。在丰富HBXIP与肿瘤发生和肿瘤辐射耐受相关性的同时，将为开发新的药物治疗靶点及癌症的综合治疗奠定基础。

本项目主要探讨HBXIP对电离辐射（IR）致DNA损伤的影响，阐明HBXIP与肿瘤细胞辐射抵抗的内在联系。我们研究发现，辐射照射能够上调肿瘤细胞中HBXIP的表达，并促进HBXIP向细胞核内迁移。HBXIP表达水平与IR诱导的DNA双链损伤密切相关，抑制细胞内HBXIP的表达促进IR诱导的DNA损伤标志分子H2AX的磷酸化及核内γ-H2AX焦点的生成；而细胞高水平表达HBXIP基因则抑制γ-H2AX的表达及核内焦点的生成，表明HBXIP参与细胞内DNA损伤的修复过程。HBXIP能够通过调控肿瘤细胞内Cdc25C-cyclinB1/Cdc2信号途径激活G2/M细胞周期检验点，从而有利于修复损伤的DNA。在敲低HBXIP的细胞中，IR诱导的ATM磷酸化水平降低，而CHK2和p53的磷酸化水平则升高。此外，HBXIP能够促进基于DNA损伤的化疗药物对肿瘤细胞的化疗敏感性，能够通过激活caspase家族成员的切割促进阿霉素诱导的肝癌细胞和骨肉瘤细胞凋亡；通过抑制DNA损伤修复和调控细胞周期阻滞及诱导凋亡促进Etoposide对乳腺癌细胞的化疗敏感性。在MCF-7乳腺癌细胞中，miR-106a诱导的Etoposide化疗敏感性与其抑制HBXIP的表达相关。miR-106a抑制MCF-7细胞的增殖与迁移，促进Etoposide诱导的细胞DNA损伤及细胞凋亡。另外，HBXIP可能通过PI3K/Akt/mTOR信号通路调控细胞DNA损伤及其凋亡。新型PI3K/mTOR抑制剂PF-04691502能够抑制细胞内HBXIP 的表达，并抑制肿瘤细胞增殖和血管生成；肿瘤细胞经PF-04691502作用后，细胞出现明显的凋亡，自噬及DNA损伤现象。另外，PI3K/Akt/mTOR通路抑制剂CCT128930也抑制HBXIP的表达，并表现出抑制细胞增殖及诱导细胞DNA损伤和凋亡的活性。本组同时也探讨了其他小分子抑制剂如MK-8776和LY2603618等的抑癌活性及其分子机制。总之，本研究在丰富HBXIP与肿瘤发生和肿瘤放化疗抵抗相关性的同时，为癌症的临床治疗及新靶点的发现奠定了理论基础。