Genistein对GRP78基因表达的影响及其在DNA辐射损伤修复中的作用机制

放疗是肿瘤患者重要的治疗手段之一，但放疗在杀伤肿瘤细胞的同时，也对人体正常组织细胞造成损伤。近年来有关大豆异黄酮减轻辐射损伤生物活性的研究受到关注。我们前期研究发现，大豆异黄酮能一定程度地减轻辐射所造成的肝细胞DNA损伤，其效应与大豆异黄酮浓度有关；同时还发现，大豆异黄酮能够提高受辐射小鼠肝细胞GRP78蛋白的表达。GRP78是内质网应激中的关键分子，上调后对细胞具有保护作用，但其在大豆异黄酮抗辐射损伤中的作用及机制不明。本项目拟进一步通过细胞实验，以大豆异黄酮主要活性物质Genistein为受试物，深入研究Genistein上调GRP78表达的信号传导途径及GRP78在DNA切除修复中的作用，阐明Genistein减轻DNA辐射损伤的作用及其机制。本研究不仅能够在理论上丰富Genistein的生物学效应及分子机制，也为临床上将Genistein作为辐射防护剂提供理论支持。

本项目以金雀异黄素Genistein 为主要受试物，研究其对人肝细胞L-02 DNA辐射损伤的保护效果及其分子机制，结果如下：.（1）利用单细胞凝胶电泳等方法，观察不同浓度（1,5,10,20μM）Genistein在细胞辐照处理后24h、48h及72h对增殖率、细胞凋亡、细胞周期的影响及其对DNA辐射损伤的保护效果。结果表明，与单纯辐照组（R组）相比，低浓度Genistein（1μM，5μM）能显著增加细胞增殖率，降低细胞凋亡率，并改变细胞周期进程，增加G2/M期阻滞；但高浓度Genistein（20μM）却显著降低细胞增殖率，增加细胞凋亡率；8Gy X射线照射后24h，各组彗星发生率均小于1%，且组间彗星尾长无显著差异；照后48h，R组彗星发生率为24.2%，彗星尾长为283.6±22.3μM，与R组相比，各浓度Genistein处理组彗星发生率和彗星尾长均显著降低；照后72h，R组彗星发生率较48h显著下降，尾长显著缩短，1μM、5μM Genistein处理组彗星发生率和尾长仍显著低于R组，但10μM及20μM Genistein组彗星发生率显著升高，尾长显著增长。.（2）利用Real time PCR和Western blot检测GRP78, HERPUD1, HHR23A, HHR23B基因的表达水平；利用基因芯片筛选DNA损伤信号通路相关基因。结果表明，在mRNA和蛋白水平，低浓度Genistein (1, 5μM)可上调HERPUD1、HHR23A、HHR23B的表达；HERPUD1上调可促进ER应激中非正确折叠蛋白的降解；同时通过与HHR23A等作用参与DNA核苷酸切除修复机制。.芯片的结果显示，低浓度Genistein还通过上调HUS1及下调MPG 的表达，启动细胞DNA辐射损伤修复，并降低细胞对辐射的敏感性。.（3）构建靶向干扰HERPUD1基因的shRNA表达载体，稳定转染L-02细胞，沉默HERPUD1蛋白的表达；实验结果表明HERPUD1基因表达被干扰后，不同时间点受辐照L-02细胞增殖率降低，较显著降低G2/M期阻滞，且荧光染色结果表明辐照处理后细胞凋亡率显著升高，DNA辐射损伤明显增强。研究结果表明HERPUD1是Genistein发挥辐射防护作用的关键靶基因之一，且是启动DNA辐射损伤修复基因的上游基因。