Hsp70的SBDα结构域对Hsp70的功能及变构调节的贡献研究

Hsp70 is a conserved molecular chaperone which is essential for life due to its participation in a wide range of cellular activities and its role in protein homeostasis. Dynamics and allosteric regulation by nucleotide and peptide is the basis for the functional cycle of Hsp70. Understanding the allosteric regulation mechanism of Hsp70 is a key problem that has been studied in depth. Although recent studies have indicated its substrate binding domain alpha-helical lid structure (SBDα) is important for function and allosteric regulation of Hsp70, the contribution of the relatively poorly conserved SBDα is a neglected aspect of the research carried out to date. This study will focus on the effect of specific SBDα sequences from different Hsp70 family members on the function of Hsp70, such as substrate binding, and the effect on interaction between Hsp70 and its co-chaperones. This study will also address the mechanistic details of how the SBDα interacts with the other domains of Hsp70 and probe significance of the SBDα in regulating allostery of Hsp70. This project will provide new insight into Hsp70 function and the mechanism of its allosteric regulation.

Hsp70是保守的生命活动必需分子伴侣，一方面参与多种细胞活动，另一方面是细胞活动的缓冲蛋白。Hsp70具有一定的动态性，受核苷酸和多肽结合的变构调节，这些构成其功能循环的基础，Hsp70的变构调节是深入探讨Hsp70作用机制的焦点问题，获得了广泛的关注和研究。多年来保守性相对较差的Hsp70的底物结合域的α螺旋盖子结构（SBDα）的研究仍相对较少，缺乏深入，近年来的研究已经提示该结构域对于Hsp70的功能和变构调节具有重要意义。本项目将致力于研究不同Hsp70的特异性的SBDα对Hsp70的底物结合等功能的影响，以及对Hsp70和辅分子伴侣相互作用的影响，研究SBDα和Hsp70其他结构域相互作用的详细机制，探索SBDα在Hsp70的变构调节中的重要意义。本项目成果将为Hsp70功能调节的机制研究提供新思路，为已有的Hsp70的变构调节机制提供新的视角。

Hsp70家族蛋白通常在结构和功能上高度保守，对生命活动至关重要，尤其是在蛋白质质量控制中发挥关键作用。Hsp70蛋白在结构上具有一定的动态性和构象不均一性，受核苷酸和底物结合的变构调节，这是其生物学功能的分子基础。Hsp70的结构域之间的相互作用，包括核苷酸结合结构域（NBD）-底物结合结构域（SBD）相互作用和SBD的α亚结构域（SBDα）-ꞵ亚结构域（SBDꞵ）相互作用，是Hsp70的变构效应的基础。在Hsp70的序列中，C末端的SBDα和无序区（C-IDR）是其序列变异度最大的区域，在进化上保守性最低。我们主要针对Hsp70的SBDα开展了三方面的探索：一，SBDα和C-IDR的进化对其分子伴侣功能的意义；二，人源应激诱导型Hsp70（HspA1A）和人源保守表达的Hsp70（HspA8）的SBDα的结构动态性与其巯基活性之间的相关性；三，HspA1A的SBDα在活细胞内响应氧化应激的结构变化过程。我们的研究结果发现SBDα降低底物结合和解离速率的作用，以及参与Hsp70与辅分子伴侣的协同作用，从低等生物到高等生物具有保守性，但是，来自高等生物Hsp70的SBDα和C-IDR不能在低等生物的Hsp70中替代其SBDα和C-IDR行使功能，而来自低等生物Hsp70的SBDα和C-IDR在高等生物的Hsp70中却能替代其SBDα和C-IDR行使一定的功能，提示SBDα-SBDꞵ相互作用的模式在生物进化过程中发生了一定的变化。此外，我们的研究结果发现HspA1A和HspA8的巯基活性差异性与其结构域之间的相互作用、变构调节和局部结构动态性有关，HspA1A和HspA8的SBDα的第一个loop区的残基差异导致两种Hsp70蛋白的SBDα具有不同的结构动态性和巯基活性。为了进一步在体内研究SBDα的功能，我们用in-cell NMR方法在大肠杆菌活细胞内检测到diamide刺激导致HspA1A的SBDα逐渐发生去折叠，并在半小时后发生重折叠和构象逐渐复原的变化过程，显示HspA1A的SBDα具备在细胞内通过去折叠和重折叠调节其分子伴侣活性的可能性。本项目成果为Hsp70功能调节的机制研究提供新的视角，为针对不同的Hsp70蛋白设计特异性的抑制剂提供基础。