肿瘤外泌体中miR-9介导血管生成和血管通透性对犬乳腺肿瘤转移前生态位形成的调控和机制研究

Tumor metastasis is the most important cause of tumor-related death in humans and animals, and the pre-metastatic niche plays a key role in tumor metastasis. The studies indicated that microRNAs from tumor exosomes could induce angiogenesis and vascular permeability, regulate the pre-metastasis niche, and promote tumor metastasis. The studies previously found that the expression of exosomal miR-9 was up-regulated in the breast cancer, but it is not fully understood if exosomal miR-9 can cause the pre-metastatic niche and its underlying molecular mechanism. Therefore, the applicant will utilize lentivirus packaging system to construct the canine mammary tumor cell lines that is over-expression and knockdown of miR-9, and further confirm that exosomal miR-9 will be delivered to the vascular endothelial cells base on the truth that exosome secreted by canine mammary tumor can be intaken into vascular endothelial cells . Then, by analyzing the effects of those exosomes on angiogenesis and vascular permeability, the role of exosomal miR-9 in regulating the pre-metastasis niche was explored. Finally, to further explain the mechanism of exosomal miR-9 in regulating pre-metastatic niche in dogs, bioinformatics software was used to screen and identify the target genes of miR-9 in vascular endothelial cells, and then study the regulation role of this target protein in key signaling pathways relate to angiogenesis and vascular permeability.

肿瘤转移是人类和动物肿瘤相关死亡的主要原因，而转移前生态位形成是肿瘤转移的关键环节。肿瘤外泌体中的microRNAs能调控转移前生态位形成，促进肿瘤转移。前期研究发现乳腺肿瘤分泌的外泌体中miR-9的表达上调，但其对转移前生态位的调控作用及机制还不完全清楚。因此申请人将在明确犬乳腺肿瘤分泌的外泌体可被犬血管内皮细胞摄取的基础上，利用慢病毒包装系统分别构建miR-9过表达和敲低的犬乳腺肿瘤细胞系并分离纯化相应的外泌体，进一步证实外泌体能将miR-9递送至血管内皮细胞内。再通过分析上述外泌体对血管生成和血管通透性的作用，探究表达miR-9的外泌体在调控肿瘤转移前生态位中扮演的角色。最后，应用生物信息学软件筛选并鉴定miR-9在血管内皮细胞内作用的靶点，研究候选靶蛋白在血管生成和血管通透性相关关键信号通路中发挥的调控作用，以进一步阐释肿瘤外泌体miR-9调控犬乳腺肿瘤转移前生态位形成的分子机制。

项目背景：. 肿瘤转移是人类和动物肿瘤相关死亡的主要原因，而转移前生态位形成是肿瘤转移的关键环节。肿瘤外泌体中的microRNAs能调控转移前生态位形成，促进肿瘤转移。.研究内容：.1.本项目利用犬胚胎心脏组织进行原代培养，并诱导其分化为犬血管内皮细胞并鉴定。之后采用超速离心法、透射电镜、western blotting、共培养和荧光显微镜观察等方法以探究犬血管内皮细胞能否摄取含miRNAs的肿瘤外泌体。.2.利用迁移实验、小管形成实验、小鼠荷瘤模型、HE染色等方法观察在体内外miRNA-9能否通过形成转移前生态位促进荷瘤小鼠的肿瘤生长、远端器官转移和血管生成。.3.利用miRNAs靶基因预测软件、真核转录组测序、双荧光素酶报告试验、RT-qPCR等方法探寻miRNA-9在血管内皮细胞中的作用靶点，进一步明确其对犬血管内皮细胞的迁移性和血管生成的关键性信号通路。.4.研究表明肿瘤微环境是缺氧的，因此探究缺氧条件下犬乳腺肿瘤外泌体中miRNA-9的表达情况及可能对血管生成发挥调控作用的miRNAs。.5.利用小管形成试验、western blotting、双荧光素酶报告试验等方法探究miRNA-708在犬乳腺肿瘤的外泌体中的表达情况及其对血管生成拟态相关的肿瘤转移前生态位的调控作用。.重要结果：. 本研究成功地培养了犬血管内皮细胞，发现其能摄取含miRNA的肿瘤外泌体。在此基础上研究发现在体外miRNA-9能够促进犬血管内皮细胞的迁移和侵袭能力，并通过靶向col15A1基因介导TGF-β、actin骨架蛋白、HIf-1、胰岛素相关等多个信号通路分子机制发挥作用；在体内没有发现miRNA-9发挥促进肿瘤血管生成和转移的作用。之后申请者建立了缺氧培养环境寻找更有价值肿瘤外泌体中的miRNAs。同时还发现miRNA708能够促进犬乳腺肿瘤的血管生成拟态作用，具有潜在的调控肿瘤转移生态位的作用。.科学意义：. 本研究紧密围绕着项目的关键因素开展，即犬乳腺肿瘤外泌体中miRNA对血管生成相关的肿瘤转移前生态位形成的调控作用，为外泌体miRNAs用于犬转移性肿瘤的早期诊断和预后判断提供理论及实践的依据。