UDP-糖基转移酶与蔗糖合成酶级联反应体系及甜菊糖苷衍生物合成

The metabolic syndrome, obesity and diabetes, has been so prevalent in the industrialized countries throughout the world because the high energy sweeteners were excessively intaked. The development of natural non-caloric and healthy sweeteners have become a hotspot. Steviol glycosides have produced as the 3rd generation sweeteners with high-potency, low-calorie and health. Application of UDP-glycosyltransferase cascade with sucrose synthase was considered as a novel method of commercial production of stevioside sweetener. We have converted the tteviol to the rebaudioside A by the UDP-glycosyltransferase cascadedisplayed on yeast cell surface with sucrose synthase. To construct a more efficient UDP-glycosyltransferase cascade with sucrose synthase, both enzymes will be tried to expresse in yeast subcellular compartments, respectively, and then the recycle of UDP and UDP-glucose and inhibition will be studied with reversed-phase HPLC assays. Then, the glucosyltransferase UGT76G1 as a chameleon enzyme on yeast cell surface will be performed the directed evolution and simultaneous analysis. The high affinity of substrate and high activity of UGT76G1 will be screened. And then the function and structure of UGT76G1 will be investigated. The research could provide the foundation for the commercial production of next-generation stevia sweeteners

糖过量摄取所引起的肥胖症和糖尿病等公众健康问题日益严重，低卡路里天然甜味剂的开发成为热点。甜菊糖具有高甜度、低热能及健康辅助功能已作为“世界第三蔗糖”开发。UDP-糖基化转移酶和蔗糖合成酶的级联反应催化体系为甜菊糖苷及其衍生物的商业化生产提供了新途径。我们已构建基于酵母展示技术的UDP-糖基化转移酶UGT76G1和蔗糖合成酶的级联反应催化体系，以甜菊糖苷衍生物合成为对象，采用反相离子对高效液相色谱分析UDP-糖基化转移酶和蔗糖合成酶定位表达和细胞区室化效应对减少底物抑制、UDP和UDP-葡萄糖总循环效率影响机制，为构建高效UDP-糖基化转移酶和蔗糖合成酶的级联反应体系提供理论依据。此外，根据甜菊糖苷合成代谢中变色龙酶UGT76G1的底物特性，通过基于酵母展示的酶分子定向进化和催化偶联化的高效筛选方法，获得不同底物亲和特异性的突变子，研究其结构与功能的关系，为系列甜菊糖苷衍生物的合成提供支撑

在构建基于酵母展示技术的UDP-糖基化转移酶UGT76G1和蔗糖合成酶的级联反应催化体系，以甜菊糖苷衍生物合成为对象，采用反相离子对高效液相色谱分析UDP-糖基化转移酶和蔗糖合成酶定位表达和细胞区室化效应对减少底物抑制、UDP和UDP-葡萄糖总循环效率影响机制，为构建高效UDP-糖基化转移酶和蔗糖合成酶的级联反应体系提供理论依据。此外，根据甜菊糖苷合成代谢中变色龙酶UGT76G1的底物特性，通过酶分子设计、改造及高效，获得不同底物亲和特异性的突变子，研究其结构与功能的关系，为系列甜菊糖苷衍生物的合成提供了重要支撑。.通过 UDP-糖基转移酶和蔗糖合成酶细胞区域定位表达设计，建立细胞区室化效应对减少底物抑制、促进 UDP 和 UDP-葡萄糖循环的影响机制，为提高 UDP-糖基转移酶与蔗糖合成酶级联反应效率提供理论基础。基于酵母细胞展示技术构建 UDP-糖基转移酶与蔗糖合成酶级联反应体系，针对变色龙酶 UGT76G1 的底物广谱性，结合酶分子定向进化及催化耦联化分析，阐明UGT76G1酶的结构与功能的关系，为该酶底物特异性改造及糖基化转移效率的提升提供基础。 .已完成发表论文5篇，完成撰写待发表论文2篇。申请专利2件，完成待申请专利1件。培养博士研究生3名，硕士研究生4名。.研究完成预期任务，达到预期目标。