毕赤酵母细胞壁蛋白质组分析及其甲醇胁迫响应机制

尽管甲醇酵母可以利用甲醇作为唯一碳源进行呼吸代谢、生物合成及能量利用，但仍然存在高浓度甲醇对细胞毒害和生长限速等问题。本研究以巴斯德毕赤酵母（甲醇酵母）为研究对象，在我们前期对巴斯德毕赤酵母转录组及GPI壁蛋白分析的基础上，提出甲醇胁迫作用可能引起细胞壁蛋白发生重组和互补效应的假说，研究通过改进的同位素和生物素双重标记的细胞壁蛋白样品制备方法，利用2D LC-MS/MS的蛋白质组学分析手段，对甲醇胁迫作用的巴斯德毕赤酵母细胞壁蛋白质组进行分析，研究其细胞壁蛋白质组对甲醇胁迫响应的规律，开展差异细胞壁蛋白对细胞环境敏感性、甲醇耐性、细胞渗漏性等影响及其功能特性研究，进一步论证细胞壁蛋白重组和互补效应对甲醇胁迫响应的假说。研究不但为巴斯德毕赤酵母对甲醇胁迫及耐性机制研究提供理论依据，而且为构建巴斯德毕赤酵母外源表达"超级"分泌体系和高效酵母展示体系的构建提供可能。

尽管甲醇酵母可以利用甲醇作为唯一碳源进行呼吸代谢、生物合成及能量利用，但仍然存在高浓度甲醇对细胞毒害和生长限速等问题。本研究以毕赤酵母（甲醇酵母）为研究对象，研究从毕赤酵母中预测到了50个潜在的GPI型蛋白，然后以这50个蛋白作为锚定蛋白构建相应的表面展示体系，通过流式细胞术和Western Blot的分析确证了13个GPI型细胞壁蛋白。利用Cre/loxP系统建立毕赤酵母中基因敲除方法，验证了毕赤酵母基因组数据预测得到的50个GPI型细胞壁蛋白中有45个蛋白被认为是非必需的细胞壁蛋白，在这些基因缺陷时细胞在正常条件下仍然可以正常生长，但大部分细胞壁蛋白的缺陷株引起细胞壁多糖的改构，其中gcw13、 gcw17、 gcw19、 gcw21和gcw22的缺陷使甲醇酵母细胞的甲醇耐性大幅度提高，初步的研究表明gcw17和 gcw19的缺陷株对EGFP的分泌表达有促进作用，为构建巴斯德毕赤酵母外源表达“超级”分泌体系和高效酵母展示体系的构建提供了基础。研究并开展细胞壁蛋白缺陷株对荧光增白剂CW、 SDS和藤黄节杆菌酶等敏感性开展了研究，发现细胞壁通过改变细胞壁多糖的含量来增加对环境的抗性。.研究对毕赤酵母细胞壁蛋白表达量高的GCW14基因敲除，及对基因敲出缺陷株进行细胞生长、外源蛋白分泌表达、细胞壁多糖及细胞壁蛋白表达分析进行研究，发现无论是以葡萄糖还是以甘油或者甲醇为碳源，缺陷菌株GS115/ΔGCW14与对照菌GS115相比生长较差，说明GCW14基因虽然不是毕赤酵母生长的必需基因，但对毕赤酵母的生长造成一定的抑制。以该细胞壁缺陷株为基础建立iTRAQ毕赤酵母细胞壁蛋白组的分析方法。为了提升细胞壁蛋白的捕捉量采取了细胞破碎、碎片收集及SDS蛋白抽提的方法，结果发现3623被分析蛋白中包含了过多的细胞内代谢途径蛋白，可能影响了低丰度细胞壁蛋白的分析。近年来发展的活细胞直接酶切法制备细胞壁蛋白质组样品的方法将为进一步论证细胞壁蛋白重组和互补效应以及毕赤酵母对甲醇胁迫及耐性机制研究提供基础。由此研究路线由原计划的由基因型（蛋白质组为功能基因组的范畴）到表型调整到表型到基因型的技术路线。.研究以发表论文4篇，其中SCI论文2篇。待发表论文2篇；申请并获授权国家发明专利3项。