甜菊糖苷生物合成相关蔗糖合酶基因SrSUS的筛选与功能解析

Steviol glycosides (SGs) are a group of tetracyclic diterpene glycosides extracted from the leaves of Stevia rebaudiana. SGs have been widely used in food, beverage, medicine and chemical industry because of their intense sweetness, low calorie and other characteristics which are different with sucrose. The biosynthesis of SGs requires a large amount of uridine diphosphate glucose (UDPG), which can transfer glucose residues to aglycone steviol under glycosylation reaction. Sucrose synthase (SUS) catalyzes the cleavage of photosynthetic product sucrose to produce large amounts of UDPG. At present, the research on SGs biosynthesis is focused on the key genes of SrUGT, while the study of SrSUS has not been reported. In this project, we are intent to carry out expression analysis of SrSUS gene family, VIGS screening, candidate SrSUS transgenic function verification and association analysis, to screen out the SrSUS gene which is closely related to the biosynthesis and accumulation of SGs, elaborate the function mechanism of candidate SrSUS in SGs accumulation, explore its excellent allele and functional haplotype, and provide excellent candidate gene for late Stevia germplasm innovation.

甜菊糖苷是从甜菊（Stevia rebaudiana Bertoni）植体（主要叶片）中提取的多种四环二萜类糖苷组分的总称，因其具有显著区别与蔗糖的高甜度、低热能等特性已被广泛应用于食品、饮料、医药、化工等领域。甜菊糖苷的生物合成是以甜菊醇为苷元，以UDPG为主要糖基供体，并经葡萄糖基转移酶（UGTs）催化系列糖基转移反应逐步完成。植物体中蔗糖合酶催化裂解光合产物蔗糖生成大量UDPG。目前对甜菊糖苷生物合成的研究集中在SrUGT关键基因方面，对SrSUS基因的研究未见报道。本项目拟通过对SrSUS家族基因的克隆、表达分析、VIGS筛选、转基因功能验证及关联分析，以期筛选出与甜菊糖苷合成及积累紧密相关的SrSUS基因，初步探明候选SrSUS基因对甜菊糖苷积累及组分比例的影响和作用机制，发掘其优异等位基因及功能单体型，为后期甜菊优质种质创新与新品种培育等工作提供优异候选基因。

甜菊糖苷是从甜菊片中提取的多种四环二萜类糖苷组分的总称，包括STV、Reb A、Reb D等，因其具有高甜度（蔗糖甜度的200-300倍）、低热能等特性已被广泛应用于食品、饮料、医药等领域。甜菊糖苷积累的总量及优质糖苷比例决定了甜菊糖苷的产量与品质。甜菊糖苷的生物合成是以甜菊醇为苷元，以UDPG为主要糖基供体，并经葡萄糖基转移酶（UGTs）催化系列糖基转移反应逐步完成。植物体中蔗糖合酶（SUS）催化裂解光合产物蔗糖生成大量UDPG。目前对甜菊糖苷生物合成的研究集中在SrUGT关键基因方面，而对SrSUS基因的研究相对较少。本项目从甜菊栽培品种中山6号转录组序列中鉴定出6个甜菊蔗糖合酶基因（SrSUS1- SrSUS6），并克隆到了4个糖合酶基因（SrSUS1，SrSUS2，SrSUS3与SrSUS6）的cDNA全长序列及基因组序列。这4个基因都具有典型的蔗糖合酶结构域，其中SrSUS1属于SUS Ⅰ 亚家族，SrSUS2与SrSUS3 属于SUS Ⅱ 亚家族，SrSUS6 属于SUS Ⅲ 亚家族。组织器官表达分析表明SrSUS1基因的表达量最高，其在开花期具有最高的表达量。SrSUS6在检测的5个组织器官几乎不表达，SrSUS2与SrSUS3基因的表达量也较低。利用VIGS技术我们发现SrSUS1与甜菊糖苷的积累成正相关，SrSUS1 基因沉默后，甜菊糖苷的合成受到显著的抑制。过表达（SrSUS1）植株甜菊糖苷的总量以及Reb A的占比都显著提高。SrSUS1基因在编码区存在5个SNPs, 形成两个Haplotypes （Hap-1与 Hap-2）。在所选择的40份甜菊种质中，Hap-2 型比 Hap-1 总苷含量高出15%左右。本项目成功鉴定出与甜菊糖苷合成密切相关的SrSUS1基因，初步探明其作用机理，并挖掘出其优异单倍型，为后期甜菊优质种质创新与新品种培育等工作提供优异候选基因。